1. dio Akteozid potiskuje osteoklastogenezu posredovanu RANKL-om inhibiranjem indukcije C-Fos i puta NF-kB i slabljenjem proizvodnje ROS-a

Dio 1 Kako Acteosides potiču rast kostiju?

Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3* 1 Istraživački institut za kliničku medicinu Nacionalnog sveučilišta Chonbuk, Institut za biomedicinska istraživanja Nacionalnog sveučilišta Chonbuk Bolnica, Jeonju, Chonbuk, Južna Koreja, 2 Odjel za ortodonciju, Institut za oralne bioznanosti i Stomatološki fakultet, Nacionalno sveučilište Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Južna Koreja, 3 Odjel za bioaktivne materijale, Istraživački centar za bioaktivne materijale, Nacionalno sveučilište Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Južna Koreja

Sažetak

Brojne su studije pokazale da su upalni citokini važni posrednici u osteoklastogenezi, uzrokujući tako prekomjernu resorpciju kostiju i osteoporozu.Akteozid, glavni aktivni spoj Rehmannia glutinosa, koji se široko koristi u tradicionalnoj istočnjačkoj medicini, ima protuupalni i antioksidativni potencijal. U ovoj smo studiji otkrili da CTE strana značajno inhibira diferencijaciju i stvaranje osteoklasta iz makrofaga koštane srži (BMM) i RAW264.7 makrofaga stimuliranih receptorskim aktivatorom liganda nuklearnog faktora-kappaB (NF-kB) (RANKL). Prethodno liječenje akteozidom također je spriječilo resorpciju kosti od strane zrelih osteoklasta na način ovisan o dozi. Akteozid (10 mM) oslabio je RANKL-stimuliranu aktivaciju p38 kinaze, kinaze regulirane izvanstaničnim signalom i c-Jun N-terminalne kinaze, a također je potisnuo aktivaciju NF-kB inhibicijom fosforilacije p65 podjedinice i inhibitora kBa. Uz to, RANKL-om posredovana povećanja ekspresije c-Fos i nuklearnog faktora aktiviranih T-stanica, citoplazme 1 (NFATc1), i proizvodnje faktora nekroze tumora-a, interleukina (IL)-1b , i IL-6 očito su bili inhibirani prethodnim tretmanom akteozidom. Nadalje, oralni akteozid smanjio je gubitak koštane mase izazvan ovarijektomijom i upalnu proizvodnju citokina na kontrolne razine. Naši podaci sugeriraju toakteozidinhibira diferencijaciju i sazrijevanje osteoklasta iz osteoklastičnih prekursora supresijom RANKL-inducirane aktivacije protein kinaza aktiviranih mitogenom i transkripcijskih faktora kao što su NF-kB, c-Fos i NFATc1. Zajedno, ovi rezultati sugeriraju daakteozidmože djelovati kao anti-resorptivno sredstvo za smanjenje gubitka koštane mase blokiranjem aktivacije osteoklasta.

Za više informacija kontaktirajte:ali.ma@wecistanche.com

Kliknite za Cistanche efekte proizvoda

Uvod

Kost se neprestano remodelira uravnoteženom aktivnošću osteoklasta i osteoblasta [1]. Osteoklasti nastaju iz hematopoetskih stanica prekursora monocitno/makrofagne loze, dok su osteoblasti mezenhimalne loze [2]. Abnormalna aktivacija osteoklasta ili smanjena osteoblastogeneza mogu poremetiti homeostazu kostiju, na kraju uzrokujući bolesti poput osteoporoze, artritisa i raka kostiju [3,4]. Osteoporoza je česta bolest kostiju koja dovodi do povećanog rizika od prijeloma. Najčešći oblik osteoporoze uzrokovan je nedostatkom estrogena kod žena u menopauzi. Lijekovi poput kortikosteroida i antiepileptika također mogu uzrokovati neravnotežu između resorpcije i formiranja kosti, što može rezultirati osteoporozom [5]. Mnogi antiresorpcijski inhibitori uključujući bisfosfonate, kalcitonin, estrogen i selektivne modulatore estrogenskih receptora korišteni su za liječenje osteoporoze. Ovi inhibitori održavaju koštanu masu inhibicijom funkcije osteoklasta [6]. Estrogenska nadomjesna terapija najpopularniji je tretman za prevenciju i liječenje postmenopauzalne osteoporoze. Međutim, dugotrajna nadomjesna terapija estrogenom može povećati rizik od raka endometrija i dojke. Stoga su mnogi istraživači usmjerili svoje napore na razvoj novog antiresorpcijskog sredstva koje nema nuspojave [7-10]. Budući da osteoklasti djeluju na resorpciju kostiju, specifično inhibiranje osteoklasta smatra se glavnim ciljem u brojnim studijama. Osteoklasti su višejezgrene divovske stanice koje formiraju mononuklearni progenitori iz obitelji monocita/makrofaga sekvencijalnom proliferacijom, diferencijacijom i fuzijom hematopoetskih stanica prekursora [11]. Čimbenik koji stimulira kolonije makrofaga (M-CSF) i aktivator receptora nuklearnog faktora (NF)-kB (RANK) ligand (RANKL) ključni su čimbenici za diferencijaciju osteoklasta[12]. Osim toga, nekoliko upalnih citokina, kao što su čimbenik tumorske nekroze (TNF) i interleukin (IL)-1b, pridonose osteoklastogenezi moduliranjem indukcije RANKL-a, osteoprotegerina i M-CSF-a [7,13]. RANKL vezanje na staničnu površinu RANK receptora dovodi do RANKL/RANK/TNFR povezanih faktora (TRAF) kompleksa koji sekvencijalno aktiviraju NF-kB i mitogenom aktivirane proteinske kinaze (MAPK), uključujući c-Jun N-terminalnu kinazu (JNK), p38 kinaza i kinaza povezana s izvanstaničnim signalom (ERK) [14]. Ova aktivacija igra ključnu ulogu u posredovanju u diferencijaciji, aktivaciji i preživljavanju osteoklasta. RANKL također aktivira ekspresiju transkripcijskih faktora kao što su nuklearni faktor aktiviranih T-stanica, citoplazmatskih 1 (NFATc1) i -Fos, koji su bitni za razvoj osteoklasta [ 7,9]. Stoga se RANKL signalizacija smatra glavnom metom antiresorpcijskih sredstava koja suzbijaju aktivaciju osteoklasta i gubitak kosti.

Akteozidje glavni aktivni spoj Rehmannia glutinosa, koji se široko koristi u tradicionalnoj istočnjačkoj medicini [15,16]. Akteozid je snažan antioksidans i ima antihepatotoksično, protuupalno i antinociceptivno djelovanje [17-20]. Prethodno smo to utvrdiliakteozidsmanjuje aktivnost tirozinaze i biosintezu melanina reguliranjem ERK signalizacije [21], štiti od oštećenja gingive posredovanog reaktivnim kisikovim vrstama (ROS) [22] i suzbija oštećenje stanica posredovano mikotoksinima [23]. Ti su učinci usko povezani sakteozidasposobnost uklanjanja ROS-a i reguliranja signalizacije posredovane MAPK-om. Osobito se predlaže da ROS posreduju signalne putove inducirane RANKL-om i stanične događaje u osteoklastima. Predtretman antioksidansima inhibirao je RANKL-induciranu aktivaciju NF-kB, ERK i IkBa, čime je suprimirana osteoklastogeneza [24]. Ovi nalazi snažno upućuju na to da je, uz protuupalno djelovanje, i antioksidativno djelovanje presudno za antiresorptivno sredstvo, dakleakteozidmože potisnuti osteoklastogenezu izazvanu RANKL-om.

U ovoj studiji istražili smo je liakteozidima terapijski učinak na gubitak koštane mase. Ispitali smo učinkeakteozido diferencijaciji osteoklasta i resorpciji kosti te povezanim staničnim mehanizmima korištenjem in vitro i in vivo eksperimentalnih sustava.

Materijali i metode

Etička izjava

Prakse njege i korištenja životinja odobrio je Odbor nacionalnog sveučilišta Chonbuk za etiku u njezi i korištenju laboratorijskih životinja (dozvola br. CBU 2010-0007). Svi pokusi u ovoj studiji provedeni su u skladu sa smjernicama Odbora za brigu i korištenje životinja Sveučilišta.

Miševi, kemikalije i laboratorijski proizvodi

Ženke ICR miševa stare četiri tjedna kupljene su od OrientBio Inc. (Seoul, Koreja) i smještene na 2261°C i 5565 posto vlažnosti u ciklusu od 12 sati svjetlo/tama sa slobodnim pristupom hrani i vodi. Akteozid (3,4-dihidroksi-b-fenetil-Oa-ramnopiranoza-Sil-(1R3)-4-O-kafeoil-bD-glukopiranozid; C29H36O15) (Sl. S1) izoliran je iz lišća Rehmannia glutinosa. Akteozid je otopljen u fosfatno puferiranoj fiziološkoj otopini (PBS) prije upotrebe. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 i M-CSF kupljeni su od R & D Systems (Minneapolis, MN, SAD). Protutijela specifična za c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa i b-aktin dobivena su od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, SAD ). Protutijela za p-p38 i p38 kupljena su od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SAD). Kompleti CalciumAssay i Osteocalcin (OC) EIA kupljeni su od BioAssay Systems (Hayward, CA, SAD) odnosno Biomedical Technologies (Stoughton, MA, SAD), kako bi se odredili biokemijski parametri seruma. Komplet za ispitivanje mišje kisele fosfataze otporne na tartrat (TRAP) (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, SAD) također je korišten za mjerenje razine TRAP5b u serumu. Osim ako nije drugačije navedeno, dodatne kemikalije su nabavljene od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, SAD), a laboratorijski proizvodi od SPL Life Sciences (Pochun, Južna Koreja).

Stanične kulture

Stanice koštane srži dobivene su iz tibija i femora 6 tjedana starih ženki ICR miševa prema prethodno opisanim metodama [25]. Suspenzija koštane srži je inkubirana u zdjelici za kulture od 100- mm u prisutnosti 50 ng/ml M-CSF. Nakon 3 dana, adherentne stanice korištene su kao makrofagi koštane srži (BMM) za induciranje osteoklastične diferencijacije. Neke stanice koštane srži su također inkubirane 48 h bez M-CSF-a, a adherentne stanice su uzgajane u mediju za diferenciranje osteoblasta, kao što je opisano drugdje [25]. Stanice makrofaga RAW264.7 uzgajane su u Dulbecco modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) dopunjenom s 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS), 2 mM L-glutamina i antibiotika. Ove su stanice korištene kao analogna stanična linija za BMM za istraživanje učinka akteozida na osteoklastogenezu.

Osteoklastična diferencijacija i TRAP bojenje

BMM su prethodno tretirani različitim koncentracijama (0–50 mM) akteozida 2 sata prije stimuliranja sa 100 ng/ml RANKL-a. Medij kulture je zamijenjen svježim medijem 2. i 5. dana. Nakon 7 dana inkubacije, kulture su fiksirane u 4 posto PBS-puferiranog paraformaldehida i obojene TRAP-om korištenjem sigma Aldrich kita prema uputama proizvođača. TRAP-pozitivne stanice izbrojane su korištenjem optičke mikroskopije, a stanice koje sadrže 3 ili više jezgri smatrane su osteoklastima. Stanice RAW 264.7 također su bile izložene 100 ng/ml RANKL-a nakon prethodnog tretmana akteozidom tijekom 2 sata, a nakon 7 dana inkubacije, stanice su obrađene za TRAP bojenje.

Mjerenje vitalnosti stanica

Viabilnost stanica određena je pomoću reagensa tetrazolijeve soli topljive u vodi (WST)-8. Ukratko, stanice BMM ili RAW264.7 uzgojene u mediju za rast koji je sadržavao 10 posto FBS-a i antibiotike tretirane su s 10 mM akteozida ili fenolnog spoja kao što je kvercetin, luteolin, apigenin ili epigalokatehin-3-galat (EGCG). WST-8 reagens je dodan u kulture nakon 48 h inkubacije. Nakon inkubacije dodatna 4 h, izmjerena je WST-8-specifična apsorbancija na 450 nm pomoću čitača mikropločica (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, SAD).

Ispitivanje resorpcije kosti

BMM (16105 stanica/ml) suspendirani su u a-MEM-u koji je sadržavao 50 ng/ml M-CSF i 100 ng/ml RANKL, zatim podijeljeni na 24-ploču s jažicama obloženu nanokristalima kalcijevog fosfata (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Južna Koreja) pri gustoći od 26104 stanica/cm2 sa i bez akteozida. Nakon inkubacije od 7 dana, stanice su uklonjene s ploča s 5 postotnim natrijevim hipokloritom, a informacije su promatrane pod optičkim mikroskopom. Resorbirana površina također je izmjerena analizatorom slike i izražena kao postotak kontrolne vrijednosti.

Western Blot analiza

Cijeli proteinski lizati pripremljeni su u puferu za lizu kako je opisano drugdje [26]. Citosolni i nuklearni proteini pripremljeni su kako je prethodno opisano [25]. Jednake količine proteinskog ekstrakta odvojene su pomoću 12-15 posto SDS-PAGE i nanešene na membrane od polivinil difluorida. Mrlje su ispitivane primarnim antitijelima preko noći na 4°C prije inkubacije sa sekundarnim antitijelima u puferu za blokiranje tijekom 1 sata. Mrlje su razvijene s pojačanom kemiluminiscencijom (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) i izložene rendgenskom filmu (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, SAD).

Test aktivnosti MAPK

Stanice su prethodno tretirane akteozidom 2 h, a zatim stimulirane RANKL-om još -30 min. Aktivnosti MAPK određivane su korištenjem kompleta za imunometrijski test, kao što je komplet za test p-p38kinaze (Assay Designs, Inc., MI, SAD), komplet za test enzima p-ERK (Assay Designs) i komplet za sendvič ELISA p-SAPK/JNK ( Cell Signaling Technology, MA, SAD). Svi postupci su slijedili upute proizvođača, a apsorbancija je mjerena čitačem mikropločica.

Test elektroforetske pokretljivosti (EMSA)

Reakcije vezanja DNA-proteina izvedene su 30 min na sobnoj temperaturi, s 10-15 mg proteina u 20 ml pufera koji je sadržavao 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poli (dI-dC), 5 posto glicerola ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30,000 CPM [a-32P] dCTP-označenih oligonukleotida i Klenow fragment DNA polimeraze. Uzorci su odvojeni na 6 posto poliakrilamidnim gelovima, koji su osušeni i izloženi rendgenskom filmu (Eastman Kodak Co.) 12-24 h na 270°C. Sekvence oligonukleotidnih početnica specifične za NF bile su 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 i 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

Test NF-kB luciferaze

Makrofagi RAW264.7 u 24-pločama s jažicama transficirani su s0.8 mg kB-luciferaze reporter vektora upotrebom 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) u skladu s uputama proizvođača. 24 sata nakon transfekcije, stanice su stimulirane s RANKL-om u prisutnosti i odsutnosti akteozida tijekom 24 sata. Stanice su resuspendirane u 100 ml pufera za lizu reportera (Promega, Madison, WI, USA). Jednake količine uzoraka proteina stavljene su u mikroploče 96-jažica i pomiješane sa supstratom luciferaze. Luminescencija je mjerena korištenjem mikropločastog luminometra (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Njemačka). U ovom eksperimentu korišten je permeabilni NF-B inhibitorni peptid (BIOMOL, Butler Pike, PA, SAD) kao pozitivni kB inhibitor.

Mjerenje citokina

BMM ili RAW264.7 stanice stimulirane su s RANKL u prisutnostiakteozidu 24-pločama s kulturom bunara. Nakon 48 h inkubacije, supernatanti kulture su sakupljeni i procijenjeni ELISA-om pomoću TNF-a-, IL-1b- i IL-6-specifičnih OptEIATM kompleta prema uputama proizvođača.

Reverzna transkripcija u stvarnom vremenu-lančana reakcija polimeraze (RT-PCR)

Ekspresija mRNA osteoklastičnih markera, kao što su c-Fos, NFATc1 i TNF-a, određena je RT-PCR-om u stvarnom vremenu. Ukratko, ukupna RNA ekstrahirana je iz makrofaga s Trizolreagensom prema uputama proizvođača (Invitrogen). cDNA je sintetizirana s 1 mg ukupne RNA pomoću SuperScriptReverse Transcripatase II i početnica (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD) korišten je za otkrivanje nakupljanja PCR produkta tijekom ciklusa sa sustavom za otkrivanje sekvence ABI 7500 (primijenjeno upotrebom četrdeset 3-stupnjevitih ciklusa denaturacije na 95uC 15 sekundi, žarenje na 60 °C 1 sekundu i ekstenzija na 72 °C 30 sekundi. Sve PCR reakcije izvedene su najmanje u tri primjerka, a razine ekspresije normalizirane su na kućni gen HPRT u istoj reakciji. Ova studija koristila je iste opisane sekvence primera drugdje [7].

Mjerenje intracelularnog ROS-a

Osnovna otopina 29,79-diklorodihidrofluorescein-diacetata (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Njemačka) pripremljena je u DMSO i pohranjena na 220 °C u mraku. Ukratko, BMM (106 stanica/ml u 6-pločama s jažicama) uzgajane su s 50 ng/MLM-CSF tijekom 24 sata i zatim tretirane različitim koncentracijama (0-10 mM) akteozida 2 sata prije stimulacije sa 100 ng/mlRANKL. Nakon 1 sata koinkubacije, te su stanice zatim inkubirane s 25 mM DCFH-DA tijekom 30 minuta. Zelena fluorescencija 29,79-diklorofluoresceina (DCF) zabilježena je na 515 nm (FL 1) korištenjem FACS VantageH sustava (Becton-Dickinson, San Jose, CA, SAD) i 10,000 događaja brojani su po uzorku

Indukcija osteoporoze izazvane ovarijektomijom

Za ovu studiju korištene su ženke ICR miševa (stare 6 tjedana). Miševi su primili lažnu operaciju (Sham, n=10) ili kiruršku ovariektomiju (OVX, n=20) pod anestezijom. Tjedan dana nakon operacije, OVX miševi su nasumično podijeljeni u 2 skupine od po 10 miševa: bilateralni OVX i bilateralni OVX s dodatkom 200 ml PBS koji sadrži 1 mM akteozida oralno (AC skupina). Oralnoakteozidprimijenjen je jednom svaka 3 dana tijekom 8 tjedana nakon operacije, a ista količina PBS-a primijenjena je grupama Sham i OVX. Nakon 1 dana od zadnje primjene, miševi su žrtvovani, a zatim su analizirani biokemijski parametri u serumu i 3-dimenzionalna struktura kostiju.

Određivanje biokemijskih parametara seruma

Uzorci krvi prikupljeni su punkcijom srca, a serum centrifugiranjem. Uzorci seruma pohranjeni su na 280°C za analizu biokemijskih parametara. Serumske razine IL-1b i IL-6 procijenjene su korištenjem ELISA kompleta kao što je gore opisano, dok je aktivnost alkalne fosfataze (ALP) određena korištenjem biokemijskog kolorimetrijskog testa koji mjeri količinu p -nitrofenol proizveden iz p-nitrofenol fosfatnog supstrata, kako je opisano drugdje [27]. Za procjenu biomarkera formiranja i resorpcije kosti, serumske razine OC, kalcija i TRAP5b također su određene prema uputama proizvođača.

Analize strukture kostiju i morfometrijskih parametara

Femora miševa (skupine Sham, OVX i AC) je secirana i napunjena fiziološkom otopinom za mehaničko testiranje. Mehanička čvrstoća bedrene kosti izmjerena je kako je opisano drugdje [28]. Prijelomno opterećenje zabilježeno je kao vršna sila u njutnima na mjestu prijeloma središnjeg dijela desne bedrene kosti. Uz to, svijetla bedrena kost svake životinje histomorfometrijski je analizirana korištenjem sustava mikrokompjutorske tomografije (mikro-CT) (SkyScan 1076 microfocus X-ray system, Kontich, Belgija). Ukratko, kosti u skladištu s 4 posto formaldehida osušene su površinski na papirnoj maramici prije nego što su umotane u plastičnu "prianjajuću foliju" ili u parafilm, kako bi se spriječilo sušenje tijekom skeniranja. Svaka kost omotana plastikom stavljena je u cijevi od plastike/stirenske pjene koje su postavljene okomito vodoravno u komoru za uzorke 1076 skenera za mikro-CT snimanje. Skeniranje je provedeno pomoću napona izvora od 100 kV i struje izvora od 140 mA s rezolucijom od 35 mm. Trodimenzionalni modeli trabekularnih kostiju bedrene kosti rekonstruirani su pomoću SkyScan CT Analyzer verzije 1.11. Strukturni parametri kao što su trabekularna mineralna gustoća kosti (BMD, g/cm3), postotak volumena kosti (volumen kosti (BV)/volumen tkiva (TV), postotak), debljina (Tb.Th, mm), razdvajanje (Tb.Sp , mm) i broj (Tb.N, 1/mm) su tada izmjereni.

Osteogena diferencijacija i analiza mineralizacije

Stanice koštane srži uzgojene u 6-pločama s jažicama tretirane su s DAG (10 nM deksametazona, 50 mM askorbinske kiseline i 20 mM b-glicerofosfata) u prisutnosti 10 mMakteozid. Nakon 2 tjedna diferencijacije, stanice su fiksirane s ledeno hladnim 70 posto (vol/vol) etanolom tijekom 1 sata i obojene 0.2 posto alizarin crvenim sin destiliranom vodom 30 minuta na sobnoj temperatura. Nakon što su stanice uklonjene boje i osušene na zraku, ploče sa staničnom kulturom procijenjene su svjetlosnim mikroskopom pomoću invertnog mikroskopa (Nikon TS100, Japan). Da bi se kvantificirala količina crvene boje, mrlja je isprana 10-postotnim acetil piridinijevim kloridom mućkanjem 20 minuta, a apsorbancija je izmjerena na 560 nm. Količina kalcija taložena u slojevima stanica također je mjerena korištenjem Calcium Kit-a (Wako Chemical Inc. Osaka, Japan) prema uputama proizvođača. Osim toga, ekspresija mRNA markera specifičnih za kosti, kao što je transkripcijski faktor -2(Runx2), osteriks, koštani sijaloprotein (BSP) i OC, određena je RT-PCR-om u stvarnom vremenu. Oligonukleotidni primeri ovih markera dizajnirani su s veličinama proizvoda manjim od 200 bp korištenjem PrimerExpress softvera 3.0 (Applied Biosystems) kako je opisano drugdje[27].

Statistička analiza

Osim ako nije drugačije navedeno, svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost6 standardne devijacije (SD) 3 ili više neovisnih eksperimenata. Jednosmjerna ANOVA korištena je za višestruke usporedbe pomoću softvera SPSS verzija 12.0. P-vrijednost, 0.05 smatrana je statistički značajnom.

Rezultati

Akteozid inhibira stvaranje osteoklasta pomoću makrofaga na način ovisan o dozi

Kako bi se potvrdio učinak akteozida na diferencijaciju BMM-a u osteoklaste, stanice su uzgajane s različitim koncentracijama (0–20 mM) akteozida 7 dana u prisutnosti 50 ng/ml M-CSF-a i 100 ng/ml RANKL. Akteozid je smanjio broj osteoklasta na način ovisan o dozi. Kada su stanice prethodno tretirane s 10 mM akteozida tijekom 2 sata, broj osteoklasta smanjio se za 43 posto u usporedbi sa stanicama koje su dobile M-CSF i RANKL (slika 1A). Slika 1B prikazuje diferencijaciju osteoklasta posredovanu RANKL-om i njegovu inhibiciju kombiniranim tretmanom s akteozidom. U skladu s ovim rezultatom, prethodna obrada akteozidom smanjila je RANKL-stimuliranu diferencijaciju stanica RAW264.7 i stvaranje osteoklasta (slike 1C i D). Kada se anti-osteoklastični potencijal akteozida na BMM-ima usporedi s anti-osteoklastnim potencijalom nekoliko fenolnih spojeva pri istoj koncentraciji (10 mM), luteolin je pokazao najveću aktivnost (Slika 2A). Međutim, sami luteolin, kvercetin ili apigenin smanjili su vitalnost stanica (slika 2B). Svi spojevi su inhibirali osteoklastičnu diferencijaciju pomoću RAW264.7 makrofaga sa sljedećim relativnim aktivnostima: luteolin. kvercetin=apigenin .EGCG=akteozid (slika 2C). Luteolin, kvercetin ili sam apigenin također su pokazali smanjenu vitalnost stanica (slika 2D). Nasuprot tome, liječenje kvercetinom uzrokovalo je samo značajno smanjenje održivosti u BMM i RAW264.7 stanicama, kada su te stanice bile izložene 10 mM svakog spoja tijekom 2 dana s 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, ili oboje (podaci nisu prikazani). Kada je potrebna koncentracija ovih spojeva za inhibiciju 50 posto

stvaranje osteoklasta u BMM (IC50) izračunato je pomoću krivulja koncentracija-aktivnost, IC50 odakteozid, kvercetin, luteolin, apigenin i EGCG bio je 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 i 6,6 mM, redom (slika 2E). Ovaj je rezultat bio sličan slučaju kada su ispitivani makrofagi RAW264.7. Ovi podaci sugeriraju da su luteolin i kvercetin imali antiklastogenu aktivnost veću od akteozida. Nasuprot tome, kvercetin na IC50 također je imao blagi toksični učinak na stanice (podaci nisu prikazani).

Akteozid inhibira resorpciju kosti od strane makrofaga

Akteozid je također spriječio resorpciju kosti posredovanu RANKL-om na način ovisan o dozi, kako je izmjereno modelnim sustavom in vitro (Slika 3A). Resorpcija kosti bila je značajno inhibirana kada su BMM inkubirani s 1 mM akteozida (slika 3B). 10 mMakteozidtretman je gotovo potpuno oslabio informacije izazvane RANKL-om pomoću BMM-a. Slično, akteozid je smanjio resorpciju kosti u RANKL-stimuliranim RAW264.7 stanicama (Slike S2A i B). Sposobnost akteozida da inhibira resorpciju kosti ovisila je o vremenu liječenja u odnosu na RANKL stimulaciju. Akteozid (10 mM) dodan 4 dana nakon stimulacije RANKL-om nije smanjio informacije u BMM-ovima, dok je potisnuo broj nastalih osteoklasta (slika 3C). Ovaj drugačiji rezultat bio je djelomično posljedica područja jamica koje je već formirano nakon 4 dana formiranja RANKL stimulacije (Sl. 3D).

Akteozid smanjuje rane RANKL signalne putove

RANKL inducira aktivaciju 3 dobro poznata MAPK i NF-kB u prekursorima osteoklasta, a ta je aktivacija potrebna za ranu diferencijaciju osteoklasta. Kako bismo razumjeli moguće mehanizme kojima akteozid inhibira osteoklastogenezu, istražili smo učinakakteozidna MAPK i aktivaciju NF-B u makrofagima. BMM i RAW264.7 stanice prethodno su tretirane s 10 mM akteozida tijekom 2 sata i zatim stimulirane s 100 ng/ml RANKL-a tijekom 30 minuta. Fosforilacija MAPK ispitana je Western blottingom i imunometrijskom analizom. RANKL je inducirao fosforilaciju p38, ERK i JNK u BMM (Slika 4A) i RAW264.7 stanicama (Slika 4B). Akteozid je spriječio ova RANKL-inducirana povećanja p-p38, p-ERK i p-JNK. Ovaj rezultat je podržan imunometrijskom analizom, koja pokazuje predtretman s 10 mMakteozidznačajno inhibirao razine fosforiliranih MAPK u tim makrofagima (slika 4C). Liječenje RANKL-om povećalo je vezanje NF-kB na DNA, dok je akteozid inhibirao aktivaciju vezanja NF-kB-DNA izazvanu RANKL-om (slika 5A). Ova je inhibicija bila izraženija u BMM nego u RAW264.7 stanicama. Akteozid je također smanjio RANKL-stimuliranu p65 i IkBa fosforilaciju u BMM i RAW264.7 stanicama (Slike 5B i C). Dodavanje 10 mMakteozida gotovo je u potpunosti inhibiralo i razgradnju i aktivaciju IkBa u BMM-ovima (slika 5B). Kako bi se dalje potvrdilo da je NF kB aktivacija uključena u djelovanje akteozida, kB promotor-luciferaza konstrukti su prolazno transficirani u RAW264.7 stanice. Stanice inkubirane sa 100 ng/ml RANKL-a imale su 3-puta višu kB promotorsku aktivnost, koja je značajno oslabljena s 10 mM akteozida (Slika 5D).

Akteozid potiskuje proizvodnju upalnih citokina i ekspresiju TNF-a, c-Fos i NFATc1 u RANKL-stimuliranim makrofagima

TNF-a, IL-1b i IL-6 važni su u formiranju i funkciji osteoklasta, što je posredovano NF-kB signalizacijom u RANKL-stimuliranim makrofagima. RANKL je stimulirao proizvodnju ovih citokina, a ta je proizvodnja bila značajno smanjena za 10 mMakteozidprethodna obrada u BMM-ovima (slika 6A). Slično, akteozid je oslabio RANKL-induciranu proizvodnju citokina, osim IL-6, u RAW264.7 makrofagima (slika S3). Kako bismo razumjeli molekularne mehanizme djelovanja akteozida u osteoklastogenezi, dodatno smo ispitali učinak akteozida na ekspresiju TNF-a, c-Fos i NFATc1. RANKL je pojačao ekspresiju mRNA ovih faktora u BMM i RAW264.7 stanicama (Slike 6B i C). Predtretman s 10 mM akteozida značajno je inhibirao RANKL-induciranu ekspresiju ovih čimbenika u oba

BMM i RAW264.7 ćelije. Predtretman akteozidom također je snažno smanjio razine proteina c-Fos i NFATc1 u RANKL-stimuliranim BMM-ovima (slika 6D). Ovi rezultati sugeriraju da akteozid snižava RANKL inducirajući posrednike stvaranja osteoklasta na razini gena i proteina.

Akteozid smanjuje unutarstanično stvaranje ROS-a u BMM-ima na način ovisan o dozi Budući da je poznato da je unutarstanična proizvodnja ROS-a u korelaciji s osteoklastogenezom stimuliranom RANKL-om, istražili smo inhibira li akteozid proizvodnju ROS-a tijekom diferencijacije osteoklasta posredovane RANKL-om pomoću boje propusne za stanice, osjetljive na oksidaciju , DCFH-DA. Analiza protočne citometrije pokazala je da je srednji signal fluorescencije specifičan za DCF u BMM-ima očito pomaknut udesno nakon stimulacije s RANKL, u usporedbi s netretiranim kontrolnim stanicama (Slika 7A). Ovaj pomak bio je sličan slučaju da su RAW264.7 makrofagi opaženi nakon RANKL stimulacije (podaci nisu prikazani). Tretiranje BMM-a s akteozidom smanjilo je intenzitet signala DCF-a na način ovisan o dozi. Prethodni tretman s 10 mM akteozida gotovo je potpuno smanjio razine unutarstaničnog ROS-a proizvedenog tijekom diferencijacije osteoklasta na netretirane kontrolne razine (Slika 7B).

Oralna primjena akteozida inhibira promjenu osteoporotičkih biokemijskih markera i gubitak koštane mase kod ovariektomiranih miševa

Kako bismo istražili učinak akteozida na gubitak koštane mase, pripremili smo osteoporotični životinjski model ovariektomijom. Postojala je značajna razlika u tjelesnoj težini između OVX i Shammice tijekom eksperimentalnog razdoblja (podaci nisu prikazani). Grupa je imala značajno više razine IL-1b i IL-6 u serumu nego grupa Sham (slika 8). Ovariektomijom inducirana povećanja ovih upalnih citokina oslabljena su oralnom primjenom akteozida (AC skupina). Serumske razine markera koštane pregradnje kao što su ALP, kalcij, TRAP5b i OC bile su značajno povećane u skupini OVX. Od ovih markera osteoporoze, povećane razine kalcija, TRAP5b i OC u OVX miševa bile su očito inhibirane tretmanom akteozidom, dok serumska razina ALP nije promijenjena tretmanom. Prosječno maksimalno opterećenje prijeloma do sredine dijafize desne bedrene kosti bilo je značajno niže u skupini OVX nego u skupini Sham (Slika 9A). Liječenje akteozidom podiglo je maksimalnu rezervu prijeloma u odnosu na skupinu Sham. Kada je kortikalna kost bedrene kosti secirana i promatrana optičkom mikroskopijom, osteoporotične značajke prikazane u OVX skupini gotovo su potpuno nestale u AC miševa (Slika 9B). Kako bi se potvrdio učinak akteozida na modelu osteoporoze izazvane OVX-om, BMD i morfološki parametri kostiju u trabekuli proksimalnog proksimalnog femura analizirani su mikro-CT-om. Kao što je prikazano na slici 9C, promjena femoralne trabekularne arhitekture pronađena je u OVX miševa, dok je ta promjena smanjena tretmanom s acteoside. Rezultati mikro-CT analize otkrili su da je BMD, mjera čvrstoće kostiju, dramatično smanjen u OVX miševa (Slika 9D). U usporedbi sa skupinom Sham, OVX miševi su također pokazali značajne promjene u BV/TV, Tb. Sp i Tb. N, ali ne u Tb.Th. Oralni tretman akteozidom OVX miševa značajno je spriječio promjenu BMD-a kao i BV/TV i Tb.N.

Akteozid ne utječe na osteoblastogenezu u stanicama koštane srži

Uloga akteozida u diferencijaciji osteoblasta dodatno je istražena korištenjem stanica koštane srži. Kao što je prikazano na slici 10A, liječenje DAG-om povećalo je broj stanica obojenih alizarinom crveno i to se nije promijenilo prethodnim tretmanom s 10 mM akteozida. Količina prisutne boje pokazala je da kombinirani tretman akteozidom i DAG-om nije promijenio mineralizaciju (slika 10B). Slično tome, DAG-inducirana povećanja unutarstaničnog sadržaja kalcija (Slika 10C) i razina mRNA (Slika 10D) koštano specifičnih markera, kao što su Runx2, osterix, BSP i OC, nisu bila pod utjecajem prethodnog tretmana sakteozid.