Sažetak

Cilj:
Istražiti učinke akteozida na aktivnost osteoblasta i osteoklasta kod ovarijektomiranih (OVX) miševa.

Metode:
Mišji model postmenopauzalne osteoporoze uspostavljen je ovarijektomijom (OVX). Pedeset C57BL/6 miševa nasumično je podijeljeno u pet skupina: lažno operirana skupina, modelna skupina, estrogenska skupina, skupina s niskom dozom akteozida i skupina s visokom dozom akteozida, s 10 miševa u svakoj skupini.

Zabilježena je tjelesna težina. Histomorfometrijska analiza kosti učinjena je mikro-kompjutoriziranom tomografijom (mikro-CT). Serumske razine estradiola (E2), CTX-1, PINP i ALP izmjerene su pomoću odgovarajućih testnih kompleta. Zabilježena je težina maternice. TRAP bojenje korišteno je za promatranje broja osteoklasta. Imunohistokemija je korištena za otkrivanje ekspresije proteina Runx2. Kvantitativna RT-PCR (qRT-PCR) i Western blot analiza u stvarnom vremenu korištene su za procjenu ekspresije markera povezanih s formiranjem i resorpcijom kosti.

Rezultati:
U usporedbi s lažno operiranom skupinom, miševi u modelnoj skupini pokazali su značajno povećanu tjelesnu težinu, značajno smanjenu težinu maternice i razine E2, PINP i ALP u serumu te značajno povećane razine CTX-1 u serumu. Parametri kostiju uključujući BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, PINP, ALP, Runx2, OCN i Col1 značajno su smanjeni, dok je Tb.Sp značajno povećan. U femoralnom tkivu, ekspresija mRNA ALP, OCN i Col1 bila je značajno smanjena, dok je ekspresija mRNA NFATc1 i c-fos, kao i ekspresija proteina Runx2, p-IκB i p-Akt, bila značajno povećana (P<0.05P < 0.05P<0.05). The number of osteoclasts was also increased.

U usporedbi s modelnom skupinom, sve liječene skupine pokazale su značajno smanjenu tjelesnu težinu, značajno povećane razine PINP-a i ALP-a u serumu i značajno smanjene razine CTX-1 u serumu. BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, PINP, ALP, Runx2, OCN i Col1 bili su značajno povećani, dok je Tb.Sp značajno smanjen. U femoralnom tkivu, ekspresija mRNA ALP, OCN i Col1 bila je značajno povećana, dok je ekspresija mRNA NFATc1 i c-fos, kao i ekspresija proteina Runx2, p-IκB i p-Akt, značajno smanjena (P<0.05P < 0.05P<0.05). The number of osteoclasts was reduced.

Zaključak:
Akteozid ima dvostruki regulatorni učinak na remodeliranje kostiju u OVX miševa. Može poboljšati gubitak kosti izazvan OVX-om inhibicijom resorpcije kosti posredovane osteoklastima putem supresije puta NF-κB/Akt/NFATc1/c-fos, dok promiče stvaranje kosti potaknuto osteoblastom putem aktivacije osi Runx2/OCN/Col1.

Ključne riječi:
Acteoside; postmenopauzalna osteoporoza; osteoblasti; osteoklasti

Što je osteoporoza?

Osteoporoza (OP) je česta i često tiha bolest kostura koju karakterizira smanjena mineralna gustoća kostiju, pogoršanje mikrostrukture kostiju, povećana lomljivost kostiju i veći rizik od prijeloma. Globalno je pogođeno približno 18,3% stanovništva, a posebno su osjetljive žene u postmenopauzi. Ovo stanje je poznato kao postmenopauzalna osteoporoza (PMOP) [1].

Estrogen igra ključnu regulatornu ulogu u pregradnji kostiju kroz više mehanizama. Tijekom pregradnje kostiju, osteoklasti i osteoblasti održavaju dinamičku ravnotežu između resorpcije i stvaranja kosti. Kada aktivnost osteoblasta opadne i/ili aktivnost osteoklasta postane pretjerana, ova ravnoteža je poremećena, što dovodi do ozbiljnog gubitka koštanog matriksa [2].

Stoga, reguliranje funkcije i formiranja osteoblasta i osteoklasta može biti učinkovita strategija za liječenje osteoporoze povezane s nedostatkom estrogena.

Zašto tražiti biljne spojeve za osteoporozu?

Trenutačni glavni lijekovi za osteoporozu uključuju bisfosfonate, teriparatid, raloksifen i selektivne modulatore estrogenskih receptora. Ovi lijekovi mogu biti učinkoviti, ali također mogu izazvati štetne učinke kao što su gastrointestinalne nelagode i, u rijetkim slučajevima, osteonekroza čeljusti. Ove brige mogu ograničiti dugotrajnu upotrebu.

Posljednjih se godina sve veća pozornost usmjerava prema tradicionalnoj biljnoj medicini za potporu zdravlju kostiju, posebice kod postmenopauzalne osteoporoze.

Korijen remanije, tradicionalna kineska biljka, poznata je po tome što hrani bubrege i potiče cirkulaciju krvi. Često se koristi u biljnim formulama za osteoporozu [3]. Nekoliko je kliničkih studija izvijestilo da kineske biljne formule koje sadrže Rehmannia mogu poboljšati mineralnu gustoću kostiju, ublažiti bol i poboljšati kliničke simptome kod pacijenata s osteoporozom [4].

Akteozid je feniletanoidni glikozid topiv u vodi koji se nalazi u Rehmannia, Cistanche, Plantago sjemenu i drugim ljekovitim biljkama. Zabilježeno je da ima antioksidativno, protuupalno, antidijabetičko djelovanje i djelovanje na poticanje stvaranja kosti [5].

Studija temeljena na sustavnom pregledu i rudarenju podataka iz više baza podataka sugerira da bi akteozid mogao biti jedna od ključnih aktivnih komponenti u kineskim biljnim formulama za postmenopauzalnu osteoporozu [6]. Studije mrežne farmakologije također su pokazale da akteozid može biti ključni aktivni sastojak u biljnim formulama kao što su Qigu kapsula i Zuogui/Yougui pilule za liječenje postmenopauzalne osteoporoze [7,8].

Ova otkrića sugeriraju da bi akteozid mogao biti prirodni spoj koji obećava za zdravlje kostiju. Međutim, njegov točan mehanizam djelovanja još nije u potpunosti razjašnjen.

Ovo je istraživanje osmišljeno kako bi se istražili učinci akteozida na aktivnost osteoblasta i osteoklasta u modelu miša s ovariektomijom, s ciljem pružanja znanstvene osnove za daljnji razvoj akteozida u istraživanju povezanom s osteoporozom.

 

1. Materijali i instrumenti

1.1 Pokusne životinje

Pedeset 6 tjedana starih ženki C57BL/6 miševa SPF stupnja kupljeno je od Hebei Experimental Animal Center, licencni broj SCXK (Hebei) 2022-001. Miševi su težili 20-23 g.

Svi miševi su držani u 12-satnom ciklusu svjetlo/tama, sa kontroliranom sobnom temperaturom na 22±3∘C22 \\pm 3^\\circ C22±3∘C, vlagom na 55±5%55 \\pm 5\\%55±5%, te im je osigurana odgovarajuća hrana i voda. Nakon tjedan dana adaptiranog hranjenja, eksperiment je proveden.

1.2 Lijekovi i reagensi

Akteozid, s čistoćom od 98% i brojem serije CFN97048, kupljen je od Wuhan ChemFaces.

Tablete estradiolvalerata, specifikacija 1 mg × 21 tableta, kupljene su od Bayer Healthcare Co., Ltd., Guangzhou.

Kompleti za ispitivanje estradiola mišjeg seruma (E2), alkalne fosfataze (ALP), kolagena tipa I umreženog C-terminalnog telopeptida (CTX-1) i prokolagena tipa I N-terminalnog propeptida (PINP) kupljeni su od Beyotime Biotechnology, Shanghai.

RIPA pufer za lizu dobiven je od Sigme, SAD. Bio-Rad DC komplet za analizu proteina nabavljen je od Bio-Rad Laboratories, SAD. Anti-fosfo-Akt, anti-Akt, anti-fosfo-IκB i anti-IκB antitijela kupljena su od Cell Signaling Technology, SAD. Protutijelo za transkripcijski faktor 2 (Runx2) povezano s Runtom kupljeno je od Santa Cruz Biotechnology, SAD. Komplet za bojenje TRAP kupljen je od Sigme, SAD. TRIzol reagens i RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit kupljeni su od Thermo Fisher Scientific, SAD.

1.3 Glavni instrumenti

Glavni korišteni instrumenti uključivali su:

SKYSCAN 1276 mikrokompjuterski tomografski skener, Bruker Technology, Peking

Čitač mikropločica SpectraMax M, Molecular Devices, Šangaj

Elektronička analitička vaga FA2004N, Sailun Instruments, Peking

WMP-6105 optički mikroskop, Wumo Optical Instruments, Šangaj

VeritiPro kvantitativni PCR sustav u stvarnom vremenu i aparat za elektroforezu PowerEase, Thermo Fisher Scientific, Šangaj

 

2. Metode

2.1 Uspostava i grupiranje modela

C57BL/6 miševi nasumično su podijeljeni u pet skupina:

Lažno upravljana skupina

Grupa modela

Skupina estrogena, 1 mg/kg1 \\text{ mg/kg}1 mg/kg

Niska doza akteozida, 50 mg/kg50 \\text{ mg/kg}50 mg/kg

Skupina visoke doze akteozida, 150 mg/kg150 \\text{ mg/kg}150 mg/kg

Svaka grupa je sadržavala 10 miševa.

Sve životinje su anestezirane s 2% natrijevim pentobarbitalom. Napravljen je mali rez kako bi se otkrili jajnici. Jajnici su pažljivo locirani i uklonjeni kako bi se uspostavio OVX model. U lažno operiranoj skupini uklonjeno je samo masno tkivo u blizini jajnika.

Nakon operacije, svi miševi su primili intramuskularni penicilin u dozi od 50 000 U/dan tijekom 3 uzastopna dana.

Nakon operacije:

Estrogenska skupina primala je estradiolvalerat od 1 mg/kg1 \\text{ mg/kg}1 mg/kg sondom jednom dnevno.

Skupine s niskom i visokom dozom akteozida primale su akteozid putem sonde jednom dnevno.

Lažno operirane i modelne skupine dobivale su pročišćenu vodu od 10 mg/kg10 \\text{ mg/kg}10 mg/kg putem sonde.

Miševi su žrtvovani 4 tjedna nakon operacije. Prikupljeni su uzorci femoralnog tkiva i krvi. Bedrene kosti su fiksirane u 4% paraformaldehidu 48 sati i procijenjene pomoću mikro-CT-a.

2.2 Micro-CT detekcija

Lijeva bedrena kost svakog miša je skenirana mikro-CT-om visoke rezolucije. Parametri skeniranja bili su:

Napon: 50 kV

Struja: 55 μA

Izotropna rezolucija: 6 μm

Femoralno skeniranje je izvedeno na 2 mm proksimalno od ploče rasta, sa 720 sekcija skeniranih svaki put.

Micro-CT podaci analizirani su korištenjem INFINITT-Xelis softvera. Procijenjeni strukturni parametri uključivali su:

Mineralna gustoća kostiju (BMD)

Volumen kosti/ukupni volumen (BV/TV)

Trabekularna debljina (Tb.Th)

Trabekularno odvajanje (Tb.Sp)

Trabekularni broj (Tb.N)

2.3 Biokemijski pokazatelji krvi

Uzorci krvi su prikupljeni i centrifugirani na 1300 okr/min 15 minuta na 4∘C4^\\circ C4∘C. ELISA setovi korišteni su za mjerenje serumskih razina:

CTX-1, marker resorpcije kosti

PINP, marker formiranja kosti

ALP, marker formiranja kostiju

2.4 TRAP bojenje

Nakon fiksacije, bedrene kosti miša su dekalcificirane u EDTA 10 dana. Zatim su dehidrirani, umetnuti u parafin i pripremljeni u dijelove od 6 μm.

Sekcije su podvrgnute deparafinizaciji ksilenom, rehidraciji etanolom i TRAP bojenju. Nakon toga, dionice su dehidrirane, očišćene i montirane.

2.5 Imunohistokemijsko (IHC) bojenje

Za Runx2 imunohistokemiju, rezovi od 5 μm izrezani su pomoću mikrotoma, zatim deparafinizirani i hidrirani.

Endogena peroksidaza je blokirana s 0,3% vodikovim peroksidom u PBS-u tijekom 30 minuta.

Kako bi se smanjilo nespecifično bojenje, rezovi su inkubirani 1 sat u PBS-u koji je sadržavao 10% normalnog konjskog seruma i 0,1% Tritona X-100.

Sekcije su inkubirane preko noći na 4∘C4^\\circ C4∘C s anti-Runx2 primarnim protutijelom u razrjeđenju od 1:1000.

Zatim su sekcije isprane s PBS-om i inkubirane s biotiniliranim zečjim anti-kozjim IgG u razrjeđenju od 1:200 tijekom 2 sata, nakon čega je uslijedila inkubacija s kompleksom avidin-biotin-peroksidaza tijekom 1 sata.

Razvijanje boje antigena provedeno je pomoću otopine 3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorida koja sadrži 0,003% vodikovog peroksida. Za kontrastno bojenje korištena je otopina hematoksilina.

2.6 Kvantitativni RT-PCR u stvarnom vremenu (qRT-PCR)

RNA je ekstrahirana pomoću TRIzol reagensa. Količina RNA u svakom uzorku je normalizirana na 1 ug za cDNA sintezu.

cDNA je sintetizirana pomoću RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit.

qRT-PCR je izveden pomoću kvantitativnog termociklera Exicycler-96 u stvarnom vremenu.

Parametri pojačanja bili su:

Početna denaturacija na 95∘C95^\\circ C95∘C tijekom 5 minuta

40 ciklusa PCR-a u tri koraka:

Denaturacija na 95∘C95^\\circ C95∘C 1 minutu

Žarenje na 60∘C60^\\circ C60∘C 30 sekundi

Konačna ekstenzija na 72∘C72^\\circ C72∘C 1 minutu

Podaci su normalizirani korištenjem GAPDH i procijenjeni kao promjene prosječnog puta. Relativna ekspresija gena izračunata je metodom 2−ΔΔCt2^{-\\Delta\\Delta Ct}2−ΔΔCt.

2.7 Western Blot analiza

Stanice su lizirane uporabom RIPA pufera za lizu koji sadrži inhibitore proteaze i inhibitore fosfataze I i II.

Koncentracija proteina određena je pomoću Bio-Rad DC Protein Assay Kita.

Jednake količine proteina, 20ug20 \\mug20ug po stazi, nanesene su na 10% natrijev dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforeze (SDS-PAGE) gelove i prebačene na Immobilon-P poliviniliden fluoridne membrane.

Membrane su blokirane s 5% obranim mlijekom tijekom 1 sata i zatim inkubirane preko noći na 4∘C4^\\circ C4∘C s primarnim antitijelima.

Nakon tri puta ispiranja s Tris-puferiranom fiziološkom otopinom koja sadrži 0,1% Tween-20 (TBST), membrane su inkubirane s anti-mišjim ili anti-zečjim IgG peroksidazom konjugiranim sekundarnim antitijelom u razrjeđenju od 1:3000 tijekom 1 sata.

Proteini su vizualizirani kemiluminiscencijom pomoću ECL kompleta.

2.8 Statistička analiza

Sva eksperimentalna ispitivanja provedena su najmanje tri puta.

Usporedbe između više skupina provedene su korištenjem jednosmjerne analize varijance. Usporedbe u parovima između skupina provedene su korištenjem Tukeyjevog testa višestruke usporedbe.

Za statističku analizu korišten je softver SPSS 14.0. Vrijednost P<0.05P < 0.05P<0.05 was considered statistically significant.

 

3. Rezultati

3.1 Učinci akteozida na razinu E2 u serumu, težinu maternice, tjelesnu težinu i indeks maternice u OVX miševa s osteoporozom

Kao što je prikazano na slici 1, u usporedbi s lažno operiranom skupinom, miševi u modelnoj skupini imali su značajno niže razine E2 u serumu, težinu maternice i indeks maternice, dok je tjelesna težina bila značajno povećana (P<0.05P < 0.05P<0.05).

U usporedbi s modelnom skupinom, miševi u svim tretiranim skupinama pokazali su značajno smanjenu tjelesnu težinu (P<0.05P < 0.05P<0.05).

Slika 1. Učinci akteozida na razinu E₂ u serumu, težinu maternice, tjelesnu težinu i indeks maternice u OVX osteoporotičnih miševa

A. Lažno upravljana skupina
B. Grupa modela
C. Skupina estrogena
D. Niska doza akteozida
E. Visoka doza akteozida

Bilješka:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 u odnosu na skupinu modela;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

 

3.2 Učinci akteozida na histomorfometrijske parametre kostiju u OVX miševa s osteoporozom

Kao što je prikazano na slici 2, u usporedbi s lažno operiranom skupinom, miševi u modelnoj skupini pokazali su značajno smanjen BMD, BV/TV, Tb.N i Tb.Th, dok je Tb.Sp bio značajno povećan (P<0.05P < 0.05P<0.05).

U usporedbi s modelnom skupinom, sve liječene skupine pokazale su značajno povećan BMD, BV/TV, Tb.N i Tb.Th, dok je Tb.Sp značajno smanjen (P<0.05P < 0.05P<0.05).

Slika 2. Učinci akteozida na histomorfometrijske parametre kosti u OVX osteoporotičnih miševa

A. Lažno upravljana skupina
B. Grupa modela
C. Skupina estrogena
D. Niska doza akteozida
E. Visoka doza akteozida

Bilješka:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 u odnosu na skupinu modela;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

 

3.3 Učinci akteozida na pokazatelje vezane uz serumski metabolizam kostiju u OVX osteoporotičnih miševa

Kao što je prikazano na slici 3, u usporedbi s lažno operiranom skupinom, miševi u modelnoj skupini pokazali su značajno smanjene razine PINP-a i ALP-a u serumu, dok su razine CTX-1 bile značajno povećane (P<0.05P < 0.05P<0.05).

U usporedbi s modelnom skupinom, sve liječene skupine pokazale su značajno povećane razine PINP-a i ALP-a u serumu, dok su razine CTX-1 bile značajno smanjene (P<0.05P < 0.05P<0.05).

Slika 3. Učinci akteozida na pokazatelje povezane s metabolizmom kosti u serumu kod OVX osteoporotičnih miševa

A. Lažno upravljana skupina
B. Grupa modela
C. Skupina estrogena
D. Niska doza akteozida
E. Visoka doza akteozida

Bilješka:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 u odnosu na skupinu modela;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

Slika 4. Učinci akteozida na broj osteoklasta u femuru OVX osteoporotičnih miševa (TRAP bojenje)

A. Lažno upravljana skupina
B. Grupa modela
C. Skupina estrogena
D. Niska doza akteozida
E. Visoka doza akteozida

Slika 5. Učinci akteozida na ekspresiju Runx2 proteina u femoralnom tkivu OVX osteoporotičnih miševa (IHC, ×400)

A. Lažno upravljana skupina
B. Grupa modela
C. Skupina estrogena
D. Niska doza akteozida
E. Visoka doza akteozida

Slika 6. Učinci akteozida na ekspresiju mRNA ALP, OCN, Col1, NFATc1 i c-fos u femoralnom tkivu OVX miševa s osteoporozom

A. Lažno upravljana skupina
B. Grupa modela
C. Skupina estrogena
D. Niska doza akteozida
E. Visoka doza akteozida

Bilješka:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 u odnosu na skupinu modela;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

3.4 Učinci akteozida na broj osteoklasta u femoralnom tkivu OVX miševa s osteoporozom

Kao što je prikazano na slici 4, u usporedbi s lažno operiranom skupinom, broj TRAP-pozitivnih osteoklasta u modelnoj skupini bio je povećan.

U usporedbi s modelnom skupinom, broj TRAP-pozitivnih osteoklasta smanjen je u svim terapijskim skupinama.

3.5 Učinci akteozida na ekspresiju proteina Runx2 u femoralnom tkivu OVX miševa s osteoporozom

Kao što je prikazano na slici 5, u usporedbi s lažno operiranom grupom, ekspresija proteina Runx2 u femoralnom tkivu bila je smanjena u skupini modela.

U usporedbi s modelnom skupinom, ekspresija proteina Runx2 u femoralnom tkivu bila je povećana u svim terapijskim skupinama.

3.6 Učinci Acteozida na ekspresiju mRNA ALP, OCN, Col1, NFATc1 i c-fos u femoralnom tkivu OVX miševa s osteoporozom

Kao što je prikazano na slici 6, u usporedbi s lažno operiranom grupom, ekspresija mRNA femoralne ALP, OCN i Col1 značajno je smanjena u skupini modela, dok je ekspresija mRNA NFATc1 i c-fos bila značajno povećana (P<0.05P < 0.05P<0.05).

U usporedbi s modelnom skupinom, sve liječene skupine pokazale su značajno povećanu ekspresiju mRNA ALP, OCN i Col1, dok je ekspresija mRNA NFATc1 i c-fos bila značajno smanjena (P<0.05P < 0.05P<0.05).

 

Slika 7. Učinci akteozida na ekspresiju proteina p-IκB i p-Akt u femoralnom tkivu OVX osteoporotičnih miševa

A. Lažno upravljana skupina
B. Grupa modela
C. Skupina estrogena
D. Niska doza akteozida
E. Visoka doza akteozida

Bilješka:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 u odnosu na skupinu modela;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

 

4. Rasprava

Osteoporoza je uobičajena metabolička bolest kostiju karakterizirana smanjenom mineralnom gustoćom kostiju, razaranjem mikrostrukture kostiju, povećanom lomljivošću kostiju i povećanim rizikom prijeloma.

Otprilike 200 milijuna ljudi diljem svijeta boluje od osteoporoze. Uz starenje stanovništva, njegova visoka učestalost i mortalitet predstavljaju veliki teret za društvo.

Postmenopauzalna osteoporoza uglavnom je uzrokovana nedostatkom estrogena i najčešća je vrsta osteoporoze. Njegove tipične značajke uključuju opadanje razine estrogena i kontinuirani gubitak kalcija starenjem.

Patološki mehanizam osteoporoze karakterizira smanjenje koštane mase i destrukcija trabekularne mikrostrukture. To izravno proizlazi iz neravnoteže između stvaranja osteoklasta i osteoblasta [9].

S obzirom na važan utjecaj nedostatka estrogena na osteoporozu, ova studija koristila je mišji model induciran ovariektomijom za procjenu antiosteoporotskih učinaka akteozida.

Prvo, ova je studija potvrdila da je OVX uzrokovao nedostatak estrogena, atrofiju maternice i gubitak kostiju kod miševa, dok je egzogeni dodatak E2 poboljšao atrofiju maternice i gubitak kostiju kod OVX miševa.

Osim toga, ova je studija otkrila da akteozid nije promijenio razinu E2 u serumu ili težinu maternice kod OVX miševa, ali je značajno poboljšao mineralnu gustoću kostiju i mikrostrukturu kostiju, čime je poboljšao gubitak koštane mase.

To se odrazilo na povećani BMD femura, BV/TV, Tb.N i Tb.Th, kao i smanjeni Tb.Sp.

Među ovim parametrima:

BMD effectively evaluates the℃of bone loss.

BV/TV odražava spužvastu koštanu masu.

Tb.N, Tb.Sp i Tb.Th uglavnom se koriste za procjenu prostorne morfologije trabekularne kosti [10].

 

Kako Acteoside može podržati remodeliranje kostiju

Neravnoteža između stvaranja i resorpcije kosti smatra se glavnim mehanizmom osteoporoze.

Trenutne terapije osteoporoze uglavnom uključuju:

Lijekovi protiv resorpcije, kao što su bisfosfonati, koji inhibiraju aktivnost osteoklasta

Anabolički agensi, kao što je paratiroidni hormon, koji potiču funkciju osteoblasta

Iako ovi lijekovi imaju jasne koristi za zdravlje kostiju, oni također mogu biti povezani s nuspojavama, uključujući mučninu, povraćanje, bolove u trbuhu i povećane rizike povezane s rakom dojke i rakom endometrija [11].

Idealna strategija za osteoporozu bila bi spoj s dvostrukom regulacijskom aktivnošću i manje nuspojava: onaj koji može inhibirati diferencijaciju osteoklasta dok pojačava aktivnost osteoblasta.

Ova je studija otkrila da akteozid smanjuje razine CTX-1 u serumu i povećava razine PINP-a i ALP-a u serumu.

Serumski ALP i PINP su markeri formiranja kosti, dok je CTX-I marker resorpcije kosti [12].

Ovi rezultati sugeriraju da akteozid može regulirati metabolizam kostiju u OVX miševa promicanjem stvaranja kostiju i inhibicijom resorpcije kostiju, pokazujući potencijalni dvostruki regulatorni učinak na pregradnju kostiju.

 

Akteozid može pomoći u smanjenju resorpcije kosti posredovane osteoklastima

Histološka analiza pokazala je da je liječenje akteozidom smanjilo broj TRAP-pozitivnih stanica, točnije osteoklasta, u trabekularnoj kosti u blizini femoralne ploče rasta OVX miševa.

Ovo sugerira da akteozid može inhibirati OVX-induciranu aktivaciju osteoklasta.

U koštanom mikrookruženju osteoklasti su specijalizirani višejezgreni makrofagi nastali diferencijacijom monocita induciranom RANKL-om i čimbenikom koji stimulira kolonije makrofaga.

RANKL-inducirana signalna kaskada igra ključnu ulogu u regulaciji aktivnosti osteoklasta. Nakon što se RANKL veže za svoj receptor RANK, on ​​regrutira faktor 6 povezan s TNF receptorom, koji dalje aktivira nizvodni put NF-κB.

U klasičnom putu NF-κB, IκB se veže za NF-κB i sprječava njegovu nuklearnu translokaciju. Tijekom diferencijacije osteoklasta, IκB se fosforilira i razgrađuje, što rezultira aktivacijom NF-κB puta.

Osim toga, Akt igra važnu ulogu u diferencijaciji osteoklasta [13]. Stimulacija RANKL i M-CSF može aktivirati Akt, koji potiče nuklearnu lokalizaciju NFATc1 putem fosforilacije glikogen sintaze kinaze 3, čime se inducira stvaranje osteoklasta.

Aktivacija NF-κB i Akt pokreće ekspresiju ključnih faktora diferencijacije osteoklasta c-fos i NFATc1. Ova dva temeljna regulatora utječu na diferencijaciju prekursora osteoklasta u zrele osteoklaste reguliranjem ekspresije gena specifičnih za osteoklaste.

Ova studija je otkrila da je liječenje akteozidom inhibiralo razgradnju IκB u femoralnom tkivu OVX miševa, blokirajući tako aktivaciju puta NF-κB. Također je specifično smanjio fosforilaciju Akt i inhibirao ekspresiju proteina c-fos i NFATc1.

Ovi rezultati pokazuju da akteozid može inhibirati diferencijaciju osteoklasta i spriječiti resorpciju kosti izazvanu OVX-om blokiranjem puteva NF-κB i Akt i regulacijom ekspresije NFATc1 i c-fos.

 

Akteozid može pospješiti stvaranje kostiju potaknuto osteoblastima

Runx2 je ključni faktor transkripcije u formiranju kostiju. Eksprimira se samo u osteoblastima i mineraliziranim tkivima i igra važnu ulogu u diferencijaciji osteoblasta inducirajući ključne markerske gene specifične za osteoblaste, uključujući ALP, OCN i Col1 [14].

Među ovim:

ALP je rani fenotipski marker diferencijacije osteoblasta. Njegova aktivnost odražava početni stadij diferencijacije osteoblasta i igra važnu ulogu u mineralizaciji kostiju iniciranjem i/ili promicanjem stvaranja kristala hidroksiapatita u vezikulama matriksa osteoblasta.

OCN i Col1 eksprimiraju se u kasnijim fazama diferencijacije osteoblasta, prateći inicijaciju mineralizacije izvanstaničnog matriksa [15].

Kroz imunohistokemijsku analizu, ova je studija otkrila da akteozid povećava ekspresiju proteina osteogenog markera Runx2 u femoralnom tkivu, sugerirajući da može pospješiti stvaranje kostiju u OVX miševa.

U isto vrijeme, smanjena regulacija osteoblast-specifičnih marker gena ALP, OCN i Col1 primijećena je u femoralnom tkivu OVX miševa, dok je tretman akteozidom djelomično poništio OVX-induciranu supresiju osteoblast-specifične genske transkripcije.

Ovi rezultati sugeriraju da akteozid može pospješiti osteogenezu pojačavanjem ranih i kasnih faza diferencijacije osteoblasta, čime se podupire diferencijacija osteoblasta i taloženje minerala.

 

Što to znači za ljude koje zanima biljna podrška za osteoporozu

Za ljude koji traže biljne ili prirodne pristupe za podršku zdravlju kostiju, ova studija nudi smislen znanstveni smjer.

Acteoside nije samo "dodatak kalcija". Umjesto toga, ovo istraživanje sugerira da bi moglo djelovati dublje pomažući regulirati ravnotežu između dvije važne vrste koštanih stanica:

Osteoblasti, koji grade kost

Osteoklasti, koji razgrađuju kosti

Zdrave kosti ovise o ravnoteži između ova dva procesa. U postmenopauzalnoj osteoporozi, resorpcija kosti često postaje jača od stvaranja kosti, što dovodi do postupnog gubitka koštane mase.

Prema ovoj studiji na miševima, akteozid može pomoći u uspostavljanju ove ravnoteže:

Podržava stvaranje kostiju povezano s osteoblastima

Smanjenje resorpcije kosti povezane s osteoklastima

Poboljšanje mineralne gustoće kostiju i strukture trabekularne kosti

Regulacija ključnih molekularnih putova povezanih s pregradnjom kosti

Za kupce zainteresirane za biljne proizvode za zdravlje kostiju, ovo pruža obećavajuću osnovu za istraživanje biljaka bogatih akteozidom kao što su Rehmannia i Cistanche.

Međutim, važno je biti odgovoran i realan: ovo je istraživanje provedeno na miševima, a ne na ljudima. Stoga akteozid ne treba predstavljati kao dokazani lijek za osteoporozu kod ljudi. Osobe kojima je dijagnosticirana osteoporoza trebaju se posavjetovati s kvalificiranim zdravstvenim djelatnikom, osobito ako već koriste lijekove na recept ili terapiju povezanu s hormonima.

Ipak, za one koji traže prirodnu strategiju za potporu kostima, acteoside je spoj vrijedan pažnje jer ga podupiru nova mehanička istraživanja.

 

Zaključak

Ukratko, čini se da akteozid ima dvostruki regulatorni učinak na remodeliranje kostiju u OVX miševa.

Može inhibirati resorpciju kosti posredovanu osteoklastima potiskivanjem aktivacije puta NF-κB/Akt/NFATc1/c-fos.

U isto vrijeme, može promicati stvaranje kostiju potaknuto osteoblastima aktiviranjem osi Runx2/OCN/Col1.

Kroz ove mehanizme, acteoside je poboljšao povećanje resorpcije kosti izazvano OVX-om i smanjenje stvaranja kostiju, što je u konačnici pomoglo smanjenju gubitka koštane mase kod miševa.

Međutim, ovo je istraživanje provedeno samo na životinjskom modelu. Buduće studije trebale bi uspostaviti odgovarajuće stanične modele kako bi se dalje istražilo kako akteozid regulira funkciju osteoblasta i osteoklasta in vitro. Također je potrebno više kliničkih studija na ljudima prije nego što se akteozid može preporučiti kao terapijska opcija za osteoporozu.

Acteoside za sada predstavlja obećavajući prirodni spoj za daljnji razvoj u području istraživanja vezanih uz zdravlje kostiju i osteoporozu.

---

Reference

[1] Brown JP. Dugotrajno liječenje postmenopauzalne osteoporoze.Endocrinol Metab (Seul), 2021, 36(3): 544–552.

[2] Fischer V, Haffner-Luntzer M. Interakcija između kostiju i imunoloških stanica: Implikacije za postmenopauzalnu osteoporozu.Semin Cell Dev Biol, 2022, 123: 14–21.

[3] He Yuchi, Liu Ya. Istraživanje molekularnog mehanizma Liuwei Dihuang pilule u liječenju osteoporoze povezane s dijabetesom na temelju mrežne farmakologije i molekularnog spajanja.Tradicionalna kineska medicina, 2025, 14(7): 6.

[4] Tan Xiaoyan, Li Xinhua, Chen Guanghua, et al. Klinička učinkovitost Liuwei Dihuang pilule u kombinaciji sa zoledronskom kiselinom u liječenju postmenopauzalne osteoporoze.China Journal of Pharmaceutical Economics, 2024, 19(10): 47–51.

[5] Xiao Y, Ren Q, Wu L. Farmakokinetička svojstva i farmakološka aktivnost akteozida: pregled.Biomed Pharmacother, 2022, 153: 113296.

[6] Zhou Yu. Sustavna procjena i istraživanje pravila o lijekovima složenih recepata tradicionalne kineske medicine za postmenopauzalnu osteoporozu i mehanizam Gujindan intervencijske terapije. Disertacija. Changchun: Sveučilište kineske medicine Changchun, 2023.

[7] Wu Tingyu, Yu Pei, Liu Zhiqiang, et al. Mehanizam Qigu kapsule protiv osteoporoze temeljen na mrežnoj farmakologiji.Časopis Sveučilišta Xinyu, 2021, 26(5): 29–37.

[8] Sun Qianhui. Studija o učincima Zuogui pilule i Yougui pilule na osteogenezu, adipogenezu i apoptozu mezenhimalnih matičnih stanica koštane srži kod ovariektomiranih štakora. Disertacija. Shenyang: Sveučilište tradicionalne kineske medicine Liaoning, 2017.

[9] Zhang QY, Gong HB, Jiang MY, et al. Regulacija enzimske peroksidacije lipida u osteoblastima štiti od postmenopauzalne osteoporoze.Nat Commun, 2025, 16(1): 758.

[10] Wang Dongdong, Ren Weimin, Chen Kai, et al. Prediktivna vrijednost mikro-CT parametara za recidiv nakon kirurškog zahvata kompresijskog prijeloma kralješka zbog osteoporoze.Znanost o slikanju i fotokemija, 2022, 40(1): 22–27.

[11] Brown JP. Dugotrajno liječenje postmenopauzalne osteoporoze.Endocrinol Metab (Seul), 2021, 36(3): 544–552.

[12] Migliorini F, Maffulli N, Spiezia F, et al. Biomarkeri kao praćenje terapije za postmenopauzalnu osteoporozu: sustavni pregled.J Orthop Surg Res, 2021, 16(1): 318.

[13] Udagawa N, Koide M, Nakamura M, et al. Diferencijacija osteoklasta prema RANKL i OPG signalnim putovima.J Bone Miner Metab, 2021, 39(1): 19–26.

[14] Gomathi K, Akshaya N, Srinaath N, et al. Regulacija Runx2 post-translacijskim modifikacijama u diferencijaciji osteoblasta.Life Sci, 2020, 245: 117389.

[15] Sharma AR, Lee YH, Gankhuyag B, et al. Učinak čestica glinice na osteogenu sposobnost osteoblasta.J Funct Biomater, 2022, 13(3): 105.