Akteozid izveden iz Cistanche poboljšava osteoporozu izazvanu glukokortikoidima aktiviranjem PI3K/AKT/mTOR puta

Sažetak

Cilj

Glukokortikoidi se široko koriste u kliničkoj praksi; međutim, mogu izazvati nuspojave, kao što suosteoporoza. Akteozid(ACT) iz Cistanche koristi se u borbi protiv raznih bolesti. Studija je provedena kako bi se procijenila učinkovitost ACT-a u glukokortikoidima izazvanimosteoporoza(GIOP) i njegov potencijalni mehanizam.

Metode
Intramuskularno je injiciran deksametazon (Dex) za induciranjeosteoporozau modelu štakora, a ACT je dan oralno. ACT je dopunjen in vivo u Dex-stimuliranomosteoblastičniMC3T3-E1 stanice. RT-qPCR je izveden za procjenu razine mRNAformiranje kostiju(Runx2, CoL1A1) i resorpciju kosti (OPG i RANKL). Za procjenu razina OC i CTX u serumu primijenjen je komercijalni ELISA kit. Western blot je proveden kako bi se procijenile razine proteina u PI3K/AKT/mTOR signalnom putu. CCK-8 test i protočna citometrija provedeni su za procjenu održivosti osteoblasta i apoptoze.

Kliknite ovdje da biste dobili Cistanche Acteoside za liječenje osteoblasta stimuliranog Dexom

Rezultati
ACT je smanjio propadanje mikrostrukture kosti izazvano Dex-om, povećao serumske razine OC i smanjio razine CTX (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and pospješuje apoptozu; međutim, ovaj je učinak uvelike oslabio ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Zaključak
DJELUJ odCistanchemože imati osteoprotektivne učinke aktiviranjem signalnog puta PI3K/AKT/mTOR za ublažavanje osteoporoze izazvane Dex-om.

Ključne riječi:Akteozid Cistancheizazvane glukokortikoidimaosteoporoza

Uvod
Osteoporoza (OP) je generalizirana bolest kostura koju karakterizira niska koštana masa, destrukcija mikrostrukture koštanog tkiva i neravnoteža u homeostazi kosti [1]. OP uzrokuje više od 8,9 milijuna prijeloma godišnje, a osteoporotični prijelomi događaju se gotovo svake 3 sekunde i dovode do doživotne invalidnosti ili smrti [2]. Glukokortikoidi (GC) se obično primjenjuju za liječenje neinfektivnih upalnih bolesti (kao što su astma i upalna bolest crijeva), kao i autoimunih stanja [3]. Međutim, dugotrajna primjena GC-a predisponira više od 30 posto slučajeva OP i više od 10 posto slučajeva osteonekroze [4]. GC izravno inhibiraju proliferaciju i diferencijaciju osteoblasta [5], smanjuju sazrijevanje i aktivnost te induciraju apoptozu osteoblasta, što zauzvrat dovodi do razvoja osteoporoze izazvane glukokortikoidima (GIOP) [6]. Štoviše, sve više dokaza ukazuje na to da je disfunkcija osteoblasta glavni uzrok gubitka koštane mase. Stoga se čini da je povećanje broja i funkcije osteoblasta glavna strategija za prevenciju OP-a, posebice GIOP-a.

Biljni lijekovi, posebno oni koji se temelje na prirodnim spojevima, prakticiraju se tisućama godina za liječenje raznih bolesti [7]. Cistanche je dragocjena biljka zabilježena u Kineskoj farmakopeji koja raste u južnom području autonomne regije Xinjiang Uygur i poznata je kao pustinjski ginseng [8]. Dokazano je da Cistanche ima različite učinke, poput jačanja imunološkog sustava, zaštite bubrega, usporavanja starenja, antioksidativnog, protuupalnog i neuroprotektivnog djelovanja [9].Akteozid(ACT) je fenil etanolni glukozid u Cistancheu, koji ima biološke aktivnosti, kao što je inhibicija neuronske apoptoze [10], ublažavanje oštećenja jetre [11], protuupalno [12], antioksidacijsko [13] , prevencija dijabetesa [14] i pretilosti [15], kao i degeneracija zglobne hrskavice [16]. Nadalje, nekoliko je studija izvijestilo o farmakokinetici ACT-a i potvrdilo da terapijski učinak postoji čak i ako je oralna iskorištenost samo 0,12 posto. ACT se smatra predlijekom s aktivnim metabolitima in vivo [17].

Zhang i sur. pokazali su potencijalni zaštitni učinak ACT-a na gubitak koštane mase izazvan ovariektomijom u štakora [18]. ACT modulira signalni put IGF-1/PI3K/mTOR kako bi se spriječio gubitak koštane mase kod štakora s dijabetesom [19]. Prijavljeno je da put PI3K/AKT/mTOR ima kritičnu regulatornu ulogu u raznim bolestima, uključujući GIOP [20]. Naringin ublažava GIOP reguliranjem signalnog puta PI3K/AKT/mTOR [21]. Dodatno, ovaj signalni put regulira diferencijaciju osteoblasta [22], formiranje kosti [23] i cijeljenje prijeloma [24]. Međutim, nije poznata potencijalna uloga ACT-a na GIOP i je li reguliran modulacijom signalnog puta PI3K/AKT/mTOR.

Cilj ove studije bio je razumjeti zaštitne učinke ACT-a u modelu GIOP štakora i osteoblastima in vitro te razjasniti temeljne molekularne mehanizme.

Materijali i metode
Pokusne životinje
Četrdeset 8- tjedana starih mužjaka Sprague-Dawley (SD) štakora težine 280-340 g dobiveno je iz Shanghai Laboratory Animal Center (CAS, Šangaj, Kina). Postupci skrbi za pokusne životinje provedeni su prema protokolu koji je odobrio Odbor za etiku životinja Treće pridružene bolnice Medicinskog sveučilišta Qiqihar. I studija je provedena u skladu sa smjernicama ARRIVE. Životinje su bile smještene u centrima za životinje bez patogena, 24 ± 2 stupnja, 12 h ciklusa svjetla i tame, 50 ± 5 posto vlažnosti, i sa slobodnim pristupom hrani i vodi.

Konstrukcija GIOP modela
Nakon 7 dana adaptiranog hranjenja, štakori su nasumično podijeljeni u kontrolne i modelne skupine korištenjem metode tablice nasumičnog broja, injiciran im je deksametazon (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, SAD) 5 mg/kg dva puta tjedno tijekom 6 tjedana. intramuskularno za induciranje OP kod štakora u modelnoj skupini [25]. Štakorima u kontrolnoj skupini (n = 10) ubrizgana je jednaka količina fiziološke otopine. U obje skupine štakora nakon 6 tjedana nisu primijećene značajne promjene u tjelesnoj težini. Zatim su štakori u modelnoj skupini podijeljeni u modelnu skupinu, skupinu s niskom dozom ACT (Model plus ACT-L) i skupinu s visokom dozom ACT (Model plus ACT-H). ACT (HPLC 98 posto) dobiven je od Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, Kina) i tretiran s vodenom suspenzijom otapala. Doza od 50 mg/kg/d i 100 mg/kg/d ACT primijenjena je oralno štakorima u skupinama s niskom i visokom dozom (8 štakora po skupini), i nastavljeno je 8 tjedana. Među njima je veličina uzorka izračunata na temelju prethodne studije [26]. Uzimajući u obzir dvostranu razinu značajnosti od 0,05 [95 postotni interval pouzdanosti (= 0.05)], 80 posto snage i veličinu učinka od 0,5, analiza snage procijenila je potrebnu veličinu uzorka od 6 životinja po skupini uz pretpostavku relevantna razina učinka od 30 posto osteoporoze. Nadalje, sa stopom odustajanja od 20 posto, 8 životinja po skupini (ukupno 32 štakora) smatralo se idealnim.

Uzorci seruma štakora
Nakon 8 tjedana, štakori su anestezirani s 10 postotnim kloral hidratom (400 mg/kg, intraperitonealno, Solarbio, Peking, Kina), krv je sakupljena iz trbušne aorte, zgrušana na sobnoj temperaturi i centrifugirana na 3500 rpm/min 10 minuta. Serum je pohranjen u epruvetama za centrifugiranje od 1,5 mL do daljnje uporabe.

Procjena mineralne gustoće kostiju
Mineralna gustoća kostiju (BMD) korištena je DAX denzitometrom kostiju malih životinja (Ranzhe Instrument Equipment Co., Šangaj, Kina). Ukratko, štakori su stavljeni u ležeći položaj, a stražnji su udovi postavljeni prema van. Desna bedrena kost štakora je skenirana prema uputama proizvođača i zabilježene su BMD vrijednosti [27].

Analiza morfologije kosti
Na kraju eksperimenta, štakori su eutanazirani intraperitonealnom injekcijom viška kloral hidrata, a bedrene kosti su fiksirane u 70 postotnom etanolu. Nakon toga, skeniranja su provedena na sustavu VivaCT 40μCT kao što je opisano u prethodnoj studiji i volumen kosti/ukupni volumen (BV/TV), koštani trabekularni broj (Tb.N), koštana trabekularna debljina (Tb.Tn) i koštano trabekularno odvajanje (Tb.Sp) su procijenjeni [28]. Za eutanaziju, SD štakori su anestezirani nakon analize morfologije kostiju intraperitonealnom injekcijom 10 posto kloral hidrata (350 mg/kg).

Imunoenzimski test (ELISA)
Komercijalni ELISA setovi korišteni su za detekciju razina osteokalcina (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) i C-terminalnog telopeptida (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) u serumu štakora. Ukratko, reagensi su uklonjeni na 18-25 stupnjeva kako bi se uravnotežila i pripremila otopina za pranje i standardni rad. Enzimske ploče. Ploče su postavljene sa standardnim, praznim i uzorcima. Otprilike 100 μL otopine uzorka za razrjeđivanje dodano je u jažice, inkubirano 90 minuta na 37 stupnjeva i zamijenjeno biotiniliranim protutijelom 60 minuta na 37 stupnjeva. Nakon ispiranja, dodana je radna otopina za vezanje enzima i inkubirana 30 minuta. Dodana je otopina supstrata (90 μL) i inkubirana 15 minuta uz zaštitu od svjetlosti. Kada se plavi gradijent pojavio u standardnim jažicama, dodano je 50 μL otopine za završetak i analizirana je promjena u OD450.

Reverzna transkripcija-kvantitativni PCR u stvarnom vremenu (RT-qPCR)
TRlzol LS reagens dodan je u serum štakora i stanica MC3T3-E1 tretiranih s ACT-om, a ukupna RNA ekstrahirana je inkubacijom na sobnoj temperaturi nakon čega je uslijedio dodatak kloroforma. Koncentracija i čistoća RNA potvrđene su mjerenjem apsorbancije A260/280 u Nanodrop ND-1000 spektrofotometru. Komplet SuperScript II reverzne transkriptaze korišten je za reverznu transkripciju RNA u cDNA. Nakon toga, cDNA je primijenjena kao predložak, dodan je primer, a SYBR-Green PCR master mix kit je pomiješan i dopunjen s ddH2O do 20 μL, a reakcija PCR amplifikacije izvedena je pomoću Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR sustav (ABI, CA, SAD). GAPDH je korišten kao interna referenca za normalizaciju, a relativne razine ekspresije izračunate su korištenjem metode 2−ΔΔCt i izvedene u tri primjerka. Slijed primera za transkripcijski faktor 2 (Runx2) povezan s Runtom, kolagen tipa I 1 (CoL1A1), aktivator receptora nuklearnog faktora-κB liganda (RANKL), osteriks i osteoprotegerin (OPG) prikazani su u tablici 1.

Western-blot analiza
RIPA lizat koji je sadržavao 1 posto inhibitora proteaze dodan je stanicama, a ukupni protein iz svake skupine sakupljen je nakon lize stanica mućkanjem 5 minuta na 4 stupnja. Za kvantificiranje koncentracije proteina u svakoj skupini korišten je BCA test kit. Nakon toga, uzorci proteina pomiješani su s 10 postotnim puferom natrijevog dodecil sulfata (SDS) u jednakom volumenu i kuhani u vodenoj kupelji na 95 stupnjeva 5 minuta radi denaturacije proteina. Pripremljen je 12-postotni SDS-poliakrilamidni vertikalni gel, a nakon što se gel skrutnuo, uzorkovano je 30 ug proteina za odvajanje gel elektroforezom od 120 mA 90 minuta. Protein je zatim prenesen na PVDF membranu na 90 V tijekom 120 minuta. Nakon zatvaranja s 5 posto goveđeg serumskog albumina, PVDF membrana je izrezana na temelju molekulske težine markera i trake ciljanog proteina i inkubirana s odgovarajućim primarnim antitijelom preko noći na 4 stupnja. Poliklonska antitijela kunića protiv p-AKT, p-mTOR i p-PI3K razrijeđena su u omjeru 1:1000 (Proteintech, Wuhan, Kina). TBST je ispran 30 minuta i inkubiran s odgovarajućim sekundarnim protutijelom obilježenim peroksidazom hrena na sobnoj temperaturi 1 h. Mrlja je vizualizirana korištenjem pojačanih kemiluminiscencijskih reagensa. Gustoća proteinskih traka je kvantificirana pomoću Image J. GAPDH je korišten kao kontrola za izračunavanje relativnih razina proteina.

Kultura stanica i grupiranje
Mišji pre-osteoblasti MC3T3-E1 kupljeni su od Kineskih zbirki kultura tkiva (CTCC, Kina) i uzgojeni u -MEM-u koji sadrži 10 posto fetalnog goveđeg seruma i 100 U/mL penicilina i 100 mg/mL streptomicina u ovlaženi inkubator na 37 stupnjeva i 5 posto CO2. Za kulturu diferencijacije kostiju, medij za osteogenu indukciju napravljen je miješanjem 10 mM- -glicerofosfata i 50 mg/mL askorbinske kiseline (Sigma-Aldrich) s -MEM i dodanim stanicama MC3T3-E1 za induciranje njihova diferencijacija. Medij je promijenjen nakon 3 dana. Kulture tijekom 14 dana korištene su za preživljavanje alkalne fosfataze (ALP). Nadalje, stanice su prethodno tretirane inhibitorom PI3K LY294002 (10 μM) tijekom 30 minuta, nakon čega je uslijedio tretman Dexom i ACT-om.

Test viabilnosti stanica
Komplet za brojanje stanica -8 (CCK-8) proveden je za procjenu održivosti osteoblasta tretiranih ACT-om. Stanice MC3T3-E1 inokulirane su u ploče s 96 jažica pri 5 × 103 stanica/jažici. Količina od 1 μM Dexa razmatrana je na temelju prethodnih studija [29] i koinkubirana s gradijentnim koncentracijama ACT (10-8, 10-7, 10-6 i 10-5 M). Medij kulture u 96-pločama s jažicama zamijenjen je nakon dodavanja medija za miješanje i reagensa CCK-8 u omjeru 10:1. Nakon nastavka inkubacije tijekom 1 sata na 37 stupnjeva, procijenjena je promjena u OD450.

Detekcija broja apoptoze osteoblasta
Stanice MC3T3-E1 koje su bile podvrgnute različitim tretmanima digestirane su pomoću tripsina bez EDTA i sakupljene centrifugiranjem. Nakon ispiranja s 1 × puferom za vezanje, dodano je 5 μL Annexin V-FITC i inkubirano na sobnoj temperaturi 5 minuta, dopunjeno s 5 μL PI i propušteno kroz 200-mrežastu najlonsku mrežu. Uzorci su analizirani sustavom protočne citometrije FACScan.

Određivanje aktivnosti ALP
Stanice MC3T3-E1 inokulirane su u 24-pločice s jažicama, a ACT i Dex dodani su nakon žbukanja. Medij stanične kulture zamijenjen je medijem za osteogenu diferencijaciju za kulturu. Nakon upotrebe otopine za lizu stanica (P0012J, Beyotime Biotechnology), supernatant je sakupljen centrifugiranjem i iscrtana je standardna krivulja. ALP kit (P0132S, Beyotime Biotechnology) korišten je za procjenu aktivnosti ALP i izračunat je OD450.

Statistička analiza
Nakon izvođenja tri neovisna eksperimenta u triplikatu, podaci su analizirani pomoću softvera GraphPad Prism 6.0 i izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. ANOVA je korištena za usporedbu statističkih razlika između više skupina. P-vrijednost < 0.05 smatrala se statistički različitom.