Novi peptid izveden iz netrina-1-pojačava zaštitu od neuronske smrti i ublažava intracerebralno krvarenje kod miševa, 1. dio

Sažetak:

Zabilježeno je da je Netrin-1 uključen u neuroprotekciju nakon ozljede središnjeg živčanog sustava. Međutim, minimalna funkcionalna domena Netrina-1 koja može očuvati neuroprotekciju, ali izbjeći glavne nuspojave Netrina ostaje nedostižna.

Središnji živčani sustav jedan je od najvažnijih živčanih sustava u ljudskom tijelu, koji kontrolira mišljenje, osjećaje i postupke ljudi. Kada je središnji živčani sustav oštećen, ljudsko pamćenje će također biti pogođeno. Ali ne brinite, možemo poduzeti neke pozitivne načine za vraćanje pamćenja.

Prvo morate razumjeti utjecaj oštećenja pamćenja. Oštećenje središnjeg živčanog sustava može utjecati na ljudske kognitivne sposobnosti, procese razmišljanja i pozornost, a sve to izravno utječe na ljudsko pamćenje. Osim toga, oštećenje središnjeg živčanog sustava također može uzrokovati emocionalnu nestabilnost, čineći ljude sklonijima panici, tjeskobi i depresiji, što utječe na oporavak pamćenja.

Međutim, iako oštećenje središnjeg živčanog sustava može imati neke negativne učinke, možemo poduzeti neke pozitivne mjere za poticanje oporavka pamćenja. Prvo, možemo isprobati neki kognitivni trening, kao što je čitanje, pisanje i rješavanje zagonetki. Ove aktivnosti mogu potaknuti mozak da proizvodi nove neurone i pomoći mu da izgradi nova sjećanja i načine razmišljanja.

Drugo, također možemo pospješiti oporavak pamćenja nekom tjelesnom vježbom. Studije su pokazale da pravilna tjelovježba može potaknuti mozak na proizvodnju novih neurona i neuronskih veza te pospješiti obradu novih informacija u mozgu. Zbog toga neki ljudi iznenada dok trče ili hodaju dođu na pamet ili riješe težak problem.

Na kraju, moramo obratiti pozornost na ulogu ispravnog unosa hrane na pamćenje. Normalno funkcioniranje mozga zahtijeva neke potrebne hranjive tvari, kao što su proteini, vitamini i elementi u tragovima. Ako našoj hrani nedostaju ti hranjivi sastojci, to će utjecati na naše pamćenje i sposobnost razmišljanja. Stoga bismo u prehrani trebali odabrati neke namirnice bogate ovim nutrijentima, poput ribe, nemasnog mesa, povrća i voća.

Ukratko, oštećenje središnjeg živčanog sustava imat će određeni utjecaj na pamćenje ljudi, ali možemo pospješiti oporavak pamćenja pravilnim kognitivnim treningom, tjelesnim vježbama i kontrolom prehrane. Nadam se da se svatko može pozitivno suočiti s izazovima u životu, zadržati optimističan stav i nastojati obnoviti zdrav središnji živčani sustav i dobro pamćenje. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche može značajno poboljšati pamćenje jer je Cistanche tradicionalni kineski lijek s brojnim jedinstvenim učincima, a jedan od njih je i poboljšanje pamćenja. Djelotvornost Cistanche dolazi od raznih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući taninsku kiselinu, polisaharide, flavonoidne glikozide itd., koji mogu na mnogo načina promicati zdravlje mozga.

Pritisnite Know za poboljšanje kratkoročnog pamćenja

Ovdje smo istraživali neuroprotektivni učinak peptida E1 izvedenog iz Netrin-10-ove EGF3 domene (ostaci 407-422). Otkrili smo da je u interakciji s izbrisanim kolorektalnim karcinomom (DCC) kako bi aktivirao fosforilaciju fokalne adhezijske kinaze koja pokazuje neuroprotekciju.

Primjena peptida E1 uspjela je poboljšati funkcionalni oporavak kroz smanjenu apoptozu u eksperimentalnom mišjem modelu intracerebralne hemoragije (ICH).

Ukratko, otkrivamo funkcionalnu sekvencu Netrin-1 koja je uključena u proces oporavka nakon ICH i identificiramo peptid kandidata za liječenje ICH.

Ključne riječi: intracerebralno krvarenje; hemin; neuroprotekcija; Netrin-1; peptid.

1. Uvod

Intracerebralno krvarenje (ICH) je razorna podvrsta moždanog udara s visokom stopom mortaliteta i morbiditeta [1-3] koja uključuje abnormalno pucanje cerebralnih krvnih žila unutar mozga [4,5].

Kirurško uklanjanje hematoma preferira se za postizanje hemostaze i smanjenje intrakranijalnog tlaka [6]. Međutim, preostali hematični ostaci i produkti razgradnje krvi još uvijek mogu promicati sekundarnu ozljedu mozga nakon ICH-a, uzrokujući oštećenje neurona i odgađajući funkcionalni oporavak [7-9].

Stoga bi razvoj učinkovitih strategija usmjerenih na oštećenje neurona izazvano sekundarnom ozljedom mozga bio koristan za liječenje moždanog udara. Netrin-1 je jedan od najbolje proučenih proteina koji regulira aksonsko vođenje i sinaptogenezu [10-12] putem interakcije sa svojim receptorima izbrisan u kolorektalnom raku (DCC) i UNC5H (nekoordinirani-5 homolog) za aktiviranje preživljavanja stanica, diferencijacije i proliferacije [13-15].

Receptori induciraju signal smrti kako bi posredovali u apoptozi kada je Netrin-1 odsutan [16]. Poznato je da vezanje Netrina-1 s DCC-om rezultira dimerizacijom DCC-a i inicira fosforilaciju tirozina 861 fokalne adhezivkinaze (FAK) kako bi se induciralo izrastanje neurita i aksonsko vođenje [17,18].

Vezanje Netrin-1 s DCC-om uključuje EGF3 domenu Netrin-1 i FN5 domenu DCC-a u aktivaciji signalnog puta Netrin-1 [19,20]. Nedavno je pokazano da Netrin-1 ima neuroprotektivne učinke u ishemijskim regijama [21].

Razina ekspresije netrina-1 u serumu, koji inhibira apoptozu stanica i potiče regeneraciju neurona, u pozitivnoj je korelaciji s oporavkom bolesnika od ishemijskog moždanog udara [22,23].

Zanimljivo je da transplantacija mezenhimalnih matičnih stanica koštane srži koje izlučuju Netrin-1 u oštećeni išijatični živac štakora pokreće regeneraciju aksona [24] i smanjuje smrt motoričkih neurona [25]. Stereotaksična injekcija proteina Netrin-1 u ventrikule smanjuje smrt živčanih stanica nakon subarahnoidalnog krvarenja aktivacijom DCC/APPL1/AKT signalizacije [26].

Polipeptid izveden iz EGF3 domene Netrin-1 (aminokiseline 423-433) značajno aktivira ERK fosforilaciju i potiče proizvodnju NO, koji ima kardioprotektivne učinke [27,28]. Međutim, Netrin-1 je identificiran kao potencijalni biomarker za tumorigenezu [29-31] jer je regulacija statusa Netrin-1 pronađena u više karcinoma porijeklom iz tkiva [32].

Kada se Netrin-1 veže na svoj receptorDCC ili Unc5H, receptori transduciraju pozitivan signal koji dovodi do preživljavanja, upale, angiogeneze i anti-apoptoze, što zauzvrat regulira tumorigenezu [31].

Stoga je vrlo važno identificirati minimalnu funkcionalnu domenu Netrina-1 koja može očuvati neuroprotekciju i izbjeći glavne nuspojave Netrina-1. Ovdje smo otkrili da peptid E1 (ostaci 407-422), koji je izveden iz EGF3 domene Netrin-1, stupa u interakciju s DCC-om kako bi zaštitio neurone od toksičnosti izazvane heminom.

U eksperimentalnom modelu ICH miševa, primjena peptida E1 poboljšala je funkcionalni oporavak, što je utvrđeno testovima ponašanja. Nadalje, peptid E1 može spriječiti degeneraciju neurona nakon ICH.

Na temelju ovih rezultata identificirali smo funkcionalnu sekvencu Netrina-1 koja je uključena u oporavak nakon ICH-a i utvrdili da se ovaj peptid može koristiti za liječenje ICH-a.

2. Rezultati

2.1. Domena EGF3 kritična je za interakciju Netrin-DCC

Netrin-1 se sastoji od VI domene, tri EGF ponavljanja i C-terminalne domene [33]. Kristalna struktura ljudskog kompleksa Netrin-1/DCC otkriva da je domena Netrin-1 EGF3 ključna za interakciju Netrin-1/DCC, ali ne i domene EGF1 i EGF2 [34].

Mutageneza ključnih aminokiselinskih ostataka (His407, Gln442 ili Gln443) na domeni EGF3 potpuno je poremetila vezanje Netrin-1/DCC [19]. EGF1/2 domene potrebne su za prebacivanje atraktivne signalizacije u odbojnu signalizaciju kada Unc5 koegzistira s DCC [20].

Stoga smo najprije generirali konstrukte pune duljine i EGF3-izbrisane (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1 (Slika 1A) i privremeno eksprimirali te konstrukte u uzgojenim HEK293T stanicama za GSTpulldown .

Vezanje je opaženo za konstrukte koji izražavaju Netrin-1, ali ne i Netrin-1(∆407-443) (Slika 1C). Ovi rezultati sugeriraju da je domena EGF3 koja sadrži aminokiseline 407–443 odgovorna za interakciju Netrin-1 s DCC. Da bismo istražili ulogu domene EGF3 u Netrin-DCC, prvo smo pročistili myc-tagged Netrin{{12 }} ili skraćeni Netrin-1 (∆407–443) (Slika 1B).

Zatim su stanice HEK293T transficirane plazmidom koji nosi DCC cDNA i inkubirane s proteinom Netrin-1, a zatim je vezivanje Netrin-1 procijenjeno imunološkim bojenjem.

Otkrili smo da se Netrin-1 pune duljine, ali ne i skraćeni Netrin-1, može vezati za DCC na plazma membrani (Slika 1D). Kako bismo odredili može li domena EGF3 djelovati u interakciji s DCC-om, generirali smo GST-EGF3 konstrukt za uklanjanje liziranih stanica koje prekomjerno izražavaju DCC. Promatrali smo specifično vezanje DCC s GST-EGF3 (Slika 1E).

Nadalje, sintetizirali smo FITC-om obilježeni peptid EGF3 i potvrdili da se, poput Netrina-1 pune duljine, mogao vezati za DCC na plazma membrani (Slika 1F). Uzeti zajedno, naši podaci pokazuju da je domena EGF3 odgovorna za interakciju Netrin-1 s DCC-om.

2.2. Domena EGF3 inducira fosforilaciju nizvodnih puteva netrina-1

Interakcija Netrin-1 i DCC aktivira višestruke signalne putove, uključujući FAK, SFK i ERK [16,35]. Fokalna adhezijska kinaza (FAK) jedna je od glavnih tirozinfosforilacijskih aktivnosti povezanih s Netrin-1/DCC signalizacijom.

Netrin-1 aktivira FAKfosforilaciju i fosforilaciju Src obitelji proteinskih tirozin kinaza (SFKs) [17]. I FAK i SFK signalni putovi igraju ključnu ulogu u razvojnoj fazi živčanog sustava i popravku ozljeda [36,37]. Štoviše, Netrin-1 može aktivirati kinazu reguliranu izvanstaničnim signalom-1/2 (ERK1/2), koja posreduje u djelovanju puta proteinkinaze aktivirane mitogenom (MAPK) [38-40].

Kako bismo istražili je li domena EGF3 kritična za aktivaciju nizvodnih signalnih putova putem vezanja Netrin-1 na DCC, prvo smo ispitali učinak domene EGF3 na fosforilaciju tirozina 861 FAK (Slika 2A) . Otkrili smo da delecija EGF3 inhibira fosforilaciju FAK u kultiviranim kortikalnim neuronima (Slika 2B, C), čime se potvrđuje bitna uloga EGF3 u signalnom putu Netrin-1.

Zatim su kultivirani kortikalni neuroni stimulirani s GST-EGF3 fuzijskim proteinom tijekom 20 minuta, a Western blotting je dodatno potvrdio da je tretman s GST-EGF3 fuzijskim proteinom inducirao FAK, ERK i SFK fosforilaciju (Slika 2D-G).

Ovi rezultati sugeriraju da EGF3 domena Netrin-1 funkcionira kao snažan stimulator za aktiviranje nizvodnih signalnih putova.

Slika 1. EGF3 domena Netrin-1 kritična je regija za interakciju Netrin-1/DCC. (A) Ilustracije Netrin-1konstrukata. Netrin-1 konstrukti su Netrin-1 pune duljine, Netrin-1-(∆407-443) i GST-EGF3. (B) Pročišćeni netrin-1-(∆407–443)-Myc/His kvantificirani su usporedbom sa standardnom krivuljom BSA. (C) Imunoblotiranje frakcije spuštene prema GST-DCC FN5 domeni fuzijskog proteina i samo GST. (D) Imunofluorescentne slike Flag-DCC koje eksprimiraju 293T stanice inkubirane s kontrolnim medijem, Netrin-1-myc/his i Netrin-1-(∆407–443) -Myc/his tijekom 30 minuta, redom, i kvantitativnim analiza. Mjerna traka, 10 µm. (E) Imunoblotiranje padajuće frakcije pomoću GST-EGF3 fuzijskog proteina i GST-a. (F) Imunofluorescentne slike Flag-DCC ekspresije 293T stanica inkubiranih s kontrolnim medijem i FITC obilježenim Pep EGF3 30 minuta, redom, i kvantitativna analiza. Mjerna traka, 10 µm.

Slika 2. Domena EGF3 aktivira nizvodne puteve Netrina-1. (A) Eksperimentalni postupak. (B) Kortikalni neuroni (E17 i DIV3) stimulirani su Netrinom-1, Netrinom-1-(∆407–443) ili kontrolnim medijem 20 min. Stanični lizati su inkubirani s anti-p-FAK-861 protutijelom kako bi se potvrdila aktivnost Netrin-1. (C) Kvantitativna analiza rezultata Western blota prikazana je u (B). n=3. (D) Kortikalni neuroni (DIV3) tretirani su s 1,5 µM GST (+), 1,5 µM GST-EGF3 fuzijskog proteina (+) ili 1,5 µM Netrin-1 (+) medijem tijekom 20 minuta. Stanični lizati su inkubirani s anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 i anti-p-ERK-202/204. (E–G) Kvantitativna analiza Western blot rezultati prikazani u (D). n=3. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SEM. Jednosmjerna ANOVA korištena je za sve statističke analize prikazane na ovoj slici (* p < 0,05, ** p < 0,01; ns, nije značajno). Pojedinosti analize podataka prikazane su u Dodatnoj tablici S1.

2.3 peptid E1 i E2 u interakciji s DCC-om kako bi aktivirali nizvodni signalni put netrina-1

Kao što je prethodno opisano, mali peptid izveden iz EGF3 domene Netrin-1 (aminokiseline 423-433) inducirao je ERK fosforilaciju [27]. Sintetizirali smo peptide E1 (ostaci 407-422) i E2 (ostaci 423-433) koji su izvedeni iz EGF3 domene Netrin-1 (Slika 3A).

Otkrili smo da je inkubacija peptida E1 povećala razine fosforiliranog FAK i SFK (Slika 3B, D, E) u stanicama kulture na način ovisan o dozi, ali nije promijenila razine fosforiliranog ERK (Slika 3B, F).

Za razliku od peptidaE1, peptid E2 ne samo da je inducirao fosforilaciju tirozina FAK (Slika 3C, G) i fosforilaciju tirozina SFK (Slika 3C, H), već je također inducirao fosforilaciju tirozina ERK (Slika 3C, I) u kultiviranim kortikalnim neuronima.

Kontrolni peptid (Pep Ctrl) nije imao vidljiv učinak na tirozinsku fosforilaciju FAK, SFK i ERK (Slika S1). Nadalje, primijetili smo da je fosforilacija komponenti FAK signalnog puta inducirana peptidom E1 ovisna o vremenu (Slika S2). Ovi rezultati pokazuju da su E1 i E2 minimalni funkcionalni peptidi Netrina-1.

Slika 3. Minimalne sekvence domene EGF3 aktiviraju nizvodne puteve Netrina-1. (A) Ilustracije peptida. (B) Kortikalni neuroni (DIV3) stimulirani su gradijentnim koncentracijama peptida E1. Stanični lizati su inkubirani s anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 i anti-p-ERK-202/204. (C) Uzgajani kortikalni neuroni tretirani su gradijentnim koncentracijama peptida E2.

Lizati su sakupljeni i inkubirani s navedenim antitijelima za mjerenje fosforilacije FAK, SFK i ERK. (D–F) Kvantifikacija opsega fosforilacije FAK, SFK i ERK inducirane peptidom E1 u neuronima prikazana je u (B). n=3. (G–I) Kvantifikacija stupnja fosforilacije FAK, SFK i ERK inducirane peptidom E2 prikazana je u (C). n=3. (J) Kortikalni neuroni izvedeni iz DCC divljeg tipa i homozigotnih mutantembrija stimulirani su s Netrin-1 ili Netrin-1-izvedenim peptidima te su lizirani.

Dobiveni lizati su podvrgnuti imunoblotingu. (K) Kvantifikacija razina FAK PY{{0}} i DCC u DCC mutiranim neuronima prikazana je u (J). n=3. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SEM. Jednosmjerna ANOVA korištena je za sve statističke analize prikazane na ovoj slici (* p < 0,05; ns, nije značajno). Pojedinosti analize podataka prikazane su u Dodatnoj tablici S1.

Kako bismo odredili je li aktivacija FAK signalnog puta ovisna o DCC-u, izmjerili smo opseg fosforilacije tirozina FAK-a induciranog ovim peptidima u DCC+/+ i DCC−/− neuronima. Otkrili smo da oba peptida E1 i E2 nisu uspjela inducirati fosforilaciju FAK u DCC−/− neuronima (Slika 3J, K).

Također smo otkrili da se sintetizirani N-terminalno Flag-označeni peptidi E1 i E2 (Flag-E1 i Flag-E2) izravno vežu s DCCFN5 domenom (Slika S3).

2.4. Peptid E1 štiti neurone od heminom izazvane stanične smrti in vitro

Kako bismo pokazali zaštitu od neuronskih ozljeda peptida E1, upotrijebili smo reakciju toksičnosti inducibilne heminom kako bismo oponašali sekundarnu ozljedu mozga nakon intracerebralne hemoragije [41,42].

Kulture neuronskih stanica koje eksprimiraju GnRH (NLT) [43-45] inkubirane su s heminom u različitim koncentracijama i trajanjima. Inkubacija NLT stanica s heminom pri srednjoj smrtonosnoj dozi (60 µM) rezultirala je vremenom ovisnim smanjenjem stope preživljavanja stanica, što sugerira da su neuroni preuzeli hemin i metabolizirali ga (Slika S4).

Kako bi se ispitalo je li ekspresija Netrin-1 i DCC odgovorila na heminom induciranu neuronsku staničnu smrt, kultivirane NLT stanice su inkubirane s heminom različita vremena. Rezultati Western blota pokazali su da su razine ekspresije Netrin-1 i DCC značajno povećane 6 sati nakon inkubacije hemina, a zatim postupno opadale (Slika 4A, B).

Kako bismo istražili mogu li peptidi E1 i E2 ublažiti heminom izazvanu neuronsku smrt, proveli smo CCK-8 test s Netrin-1, PepCtrl, peptidom E1 i peptidom E2.

Otkrili smo da ti peptidi nemaju vidljiv učinak na održivost stanica (Slika 4C i Slika S5). U usporedbi s inkubacijom s Pep Ctrl i peptidomE2, peptid E1 i Netrin-1 ublažili su neuronsku smrt izazvanu heminom (Slika 4D). Također smo obojili s calcein-AM i PI kako bismo razlikovali žive i mrtve stanice.

Rezultati su pokazali da i Netrin-1 i peptid E1 štite od smrti izazvane heminom in vitro (Slika 4E–G). Nadalje, 1,5 µM peptid E1 ublažio je heminom induciranu smrt u primarno uzgojenim neuronima (Slika 4H, I). Sveukupno, ovi su rezultati pokazali da peptid E1 štiti neurone od smrti stanice izazvane heminom.

2.5. Netrin-1-izvedeni peptid E1 potiče funkcionalni oporavak nakon ICH

Kako bismo istražili igra li peptid E1 izveden iz Netrin-1 važnu ulogu u funkcionalnom oporavku nakon moždanog udara s krvarenjem, uspostavili smo eksperimentalni ICH model kod miševa ubrizgavanjem kolagenaze pomiješane s tintom u strijatum (slika S6A).

Nakon tri dana prikazane su slike rezova mozga za praćenje položaja ubrizgavanja i volumena kolagenaze s tintom (Slika S6B, C). Miševi sa strijatalnim krvarenjem pokazali su slabost na ipsilateralnoj strani zbog ozljede mozga (Slika S7A–C).

Hematomi u strijatumu nakon ICH bili su vidljivi u usporedbi s injekcijom fiziološke otopine (Slika S7D). Relativne razine proteina Netrin-1 i DCC u perihematomskom korteksu bile su povećane kod ICH miševa u usporedbi s kontrolnim miševima drugog dana, a Netrin-1 je još uvijek bio značajno viši trećeg dana, što ukazuje da je Netrin-1 važan je za oporavak od ozljede mozga (Slika S7E, F).

Zatim je FITC-om obilježen TAT-peptid E1 (FITC-Pep TE1), koji je dodao TAT sekvencu N-kraja peptida E1, ubrizgan u ICH miševe i pokazalo se da FITC-Pep TE1 prolazi krvno-moždanu barijeru ( Slika S8).

ICH i kontrolni miševi intraperitonealno su ubrizgavani peptidom (12 mg/kg) dnevno ili jednakim volumenom slane otopine (Slika 5A). Otkrili smo da je primjena peptida TE1 poboljšala stopu preživljavanja i spasila nedostatke u tjelesnoj težini nakon ICH (Slika 5B, C).

Također smo otkrili da je volumen kolagenaze praćen jednakim omjerom tinte u svakoj skupini sličan, potvrđujući da je ovaj standardni ICH model kolagenaze rezultirao ponovljivim intrastrijatalnim hematomima (Slika 5D). Peptid TE1 poboljšao je rezultate ponašanja ICH miševa u testu uklanjanja trake (Slika 5E). ) i ispitivanje cilindra (Slika 5F).

Kao što se očekivalo, peptid TE1 smanjio je volumen infarkta nakon ICH (Slika 5G, H). Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je peptid E1 mogao smanjiti volumen hematoma i poboljšati funkcionalni oporavak u mišjem modelu ICH.

Slika 4. Peptid E1 ublažava staničnu smrt izazvanu heminom in vitro. (A) Western blot Netrin-1 i DCC u uzgojenim NLT stanicama izloženim Heminu (60 µM). (B) Kvantitativna analiza rezultata Western blota prikazana je u (A). n=3. (C) CCK-8 testovi pokazali su da serija peptida nije promijenila sposobnost preživljavanja stanica. n=4. (D) 1,5 µM Pep E1 očuvao je vitalnost NLT stanica kada je dodan dobro nakon izlaganja heminu (60 µM). n=4. (E) Živi (zeleni)/mrtvi (crveni) test NLT stanica izloženih heminu (60 µM, 6 h). Mjerna traka, 50 µm. (F, G) Kvantitativna analiza žive/mrtve analize u (E). n=9. (H) CCK-8analize pokazale su da Pep E1 može smanjiti staničnu smrt izazvanu heminom u neuronima primarne kulture. n=8. (I) Živo/mrtvo testiranje slika neurona primarne kulture (50 µM, 6 h). Mjerna traka, 50 µm. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SEM. Jednosmjerna ANOVA ili dvosmjerna ANOVA korištena je za sve statističke analize prikazane na ovoj slici (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, nije značajno). Pojedinosti analize podataka prikazane su u Dodatnoj tablici S1.

Slika 5. Netrin-1-izvedeni peptid E1 potiče proces oporavka nakon ICH. (A) Shema eksperimentalne paradigme intraperitonealne (IP) injekcije peptida TE1 u ICH modeliranju miševa. (B) Zabilježen je omjer preživljenja nakon ICH svake skupine, a primijenjena je Kaplan-Meierova metoda. n=10. (C) Promjena tjelesne težine 5 dana nakon ICH. n=6.(D) Mješavina kolaža/fiziološke otopine s jednakim omjerom tinte (ukupno 0.6 µL) ubrizgana u striatum C57 miševa, reprezentativne slike koje pokazuju područje tinte bilo je slično kod miševa tretiranih s/ bez peptida TE1 5 dana nakon ICH. (E, F) IP injekcija peptida TE1 (12 mg/kg), ali ne i kontrola TAT (12 mg/kg), poboljšano ponašanje praćeno zadatkom uklanjanja trake (E) ili zadatkom u kutu (F).

Fiziološka otopina,n=10 pojedinačne životinje; ICH, n=6 pojedinačne životinje; ICH + TAT, n=6 pojedinačne životinje; ICH + TE1, n=8 pojedinačne životinje. (G) Reprezentativni rezovi obojeni hematoksilinom i eozinom kod miševa tretiranih s/bez peptida TE1 5 dana nakon ICH. Mjerna traka, 1 mm. (H) Kvantitativno određivanje volumena krvarenja u dijelovima mozga prikazano u (G).

Fiziološka otopina, n {{0}} pojedinačnih životinja; ICH, n=6 pojedinačne životinje; ICH + TAT, n=6 pojedinačne životinje; ICH + TE1, n=8 pojedinačne životinje. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SEM. Jednosmjerna ANOVA ili dvosmjerna ANOVA korištena je za sve statističke analize prikazane na ovoj slici (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, nije značajno). Pojedinosti analize podataka prikazane su u Dodatnoj tablici S1.

2.6. Netrin-1-izvedeni peptid E1 smanjuje apoptozu neurona nakon ICH

Istražiti temeljne mehanizme peptida E1 u procesu funkcionalnog oporavka ICH. Otkrili smo degeneraciju neurona u perihematomalnoj regiji pomoću fluoro-jade C (FJC) bojenja.

Otkrili smo da je primjena peptida TE1 značajno smanjila broj FJC-pozitivnih stanica u regijama perihematoma, što ukazuje da pep TE1 inhibira degeneraciju neurona nakon ICH (Slika 6A, B). Proveli smo TUNEL bojanje i otkrili da peptid TE1 značajno smanjuje broj TUNEL-pozitivnih neurona (Slika 6C, D).

Broj TUNEL-pozitivnih astrocita nije bio detektabilna promjena nakon tretmana peptidom TE1 (Slika 6E, F). Osim toga, korištenjem FITC-obilježenog 4 kDa dekstrana kao atracera za označavanje propusnosti krvno-moždane barijere (BBB), otkrili smo da peptid TE1 nije utjecao na oporavak propusnosti BBB (Slika S9A, B).

Razine sirovih fluorescentnih jedinica (RFU) u serumu bile su slične, potvrđujući prisutnost ubrizganog markera u svim analiziranim životinjama (Slika S9C). Također smo upotrijebili lektin obilježen fluoresceinom za označavanje mikrožila, ali nismo uočili nikakvo poboljšanje nakon tretmana TE1 (Slika S9D, E). Iznad svega, ovi nalazi sugeriraju da peptid E1 potiče oporavak neurona nakon ICH inhibicijom apoptoze neurona.

Slika 6. Netrin-1-izvedeni peptid E1 može zaštititi od neuronske smrti i degeneracije, ali ne i astrocite nakon ICH. (A) Reprezentativni rezovi obojeni fluoro-jade C-om u miševa tretiranih sa/bez TE1 5 dana nakon ICH. Mjerna traka, 50 µm, odnosno 10 µm. (B) Kvantifikacija fluoro-jade C pozitivnih stanica u perihematomalnoj regiji (n=4). (C) TUNEL bojenje koje pokazuje učinke TE1 na sekundarnu ozljedu mozga (SBI) 5 dana nakon početka ICH. Reprezentativne slike iz skupina Saline, ICH, ICH + TAT i ICH + TE1.

Svaka je skupina bila podvrgnuta ICH-u osim skupine koja je primala fiziološku otopinu. Mjerna traka, 50 µm, odnosno 10 µm. (D) Kvantitativne analize za postotak TUNEL-pozitivnih neurona prikazane su u (C). n=4. (E) Kolokalizacija TUNEL-a s GFAP-om 5 dana nakon ICH. Reprezentativne slike iz Saline, ICH, ICH + TAT i ICH + TE1 grupa. Mjerna traka, 50 µm, odnosno 10 µm. (F) Kvantitativne analize za postotak TUNEL-pozitivnih astrocita prikazane su u (E). n=4. Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti ± SEM.

Jednosmjerna ANOVA korištena je za sve statističke analize prikazane na ovoj slici (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, nije značajno). Pojedinosti analize podataka prikazane su u Dodatnoj tablici S1.

3. Rasprava

Naša je studija identificirala središnju peptidnu sekvencu Netrin-1 koja je ključna za funkcionalni oporavak nakon ICH-a. Interagirajući s DCC-om, ovaj peptid izveden iz Netrin-1-a štiti od smrti neurona zbog sekundarnog oštećenja nakon ICH-a i stoga je obećavajući tretman za ICH.

Terapeutska primjena Netrina-1, proteina visoke molekularne težine, zahtijeva identifikaciju minimalne funkcionalne sekvence Netrina-1 koja potiče nizvodno signaliziranje. U našem istraživanju generirani su peptidi E1 (ostaci 407–422) i E2 (ostaci 423–433), koji su izvedeni iz EGF3 domene Netrin-1. Otkrili smo da peptid E1 (ostaci 407-422) štiti od smrti neurona nakon ICH.

Otkrili smo da su razine ekspresije Netrin-1 i DCC povećane u NLT stanicama nakon tretmana heminom. Hemin se oslobađa iz hemoglobina nakon ICH i izaziva sekundarno oštećenje i glije i neuronskih stanica [46-48].

Osim toga, također smo primijetili povećane razine proteina Netrin-1 i DCC nakon eksperimentalnog ICH. Dodatno, također smo uočili povećane razine proteina netrina-1 i DCC nakon eksperimentalnog ICH.

Ovi su rezultati u skladu s prethodnim rezultatima koji pokazuju da netrin-1 igra važnu ulogu u oporavku nakon ICH [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com