Nova homozigotna mutacija KLHL3 kao uzrok autosomno recesivnog pseudohipoaldosteronizma tipa II dijagnosticiran kasno u životu
Nov 02, 2023
Sažetak Uvod:
Pseudohipoaldosteronizam tipa II (PHA II) je Mendelov poremećaj koji karakterizira hiperkalijemijska acidoza i niske razine renina u plazmi, tipično povezani s hipertenzijom. Mutacije u WNK1, WNK4, CUL3 i KLHL3 uzrokuju PHA II, s dominantnim mutacijama u WNK1, WNK4 i CUL3 i dominantnim ili recesivnim mutacijama u KLHL3. Zabilježeno je četrnaest obitelji s recesivnim KLHL3 mutacijama, s dijagnozom u dobi od 3 mjeseca do 56 godina, obično u osoba s normalnom funkcijom bubrega.
Metode: Proveli smo klinička i genetička istraživanja kod pacijenta s hiperkalijemičnom hipertenzijom i upotrijebili simulacije molekularne dinamike, heterolognu ekspresiju u stanicama COS7 i Western blotting kako bismo istražili učinak mutacije kandidatske bolesti KLHL3 na ekspresiju proteina WNK4.
KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE BILJNU FORMULACIJU CISTANCHE ZA BUBREGE
Rezultati: Pacijentica, 58--godišnja žena iz obitelji krvnog srodstva, pokazala je hipertenziju, perzistentnu hiperkalijemijsku acidozu povezanu s jakim bolovima u mišićima, nefrolitijazu, kroničnu bolest bubrega (CKD) i koronarnu bolest srca. Terapija hidroklorotiazidom korigirala je hiperkalemiju, hipertenziju i bolove u mišićima. Genetska analiza otkrila je homozigotnu mutaciju p.Arg431Trp na visoko očuvanoj poziciji KLHL3. Simulacije su ukazale na smanjenu stabilnost mutantnog proteina, što je potvrđeno Western blotom. U usporedbi s divljim tipom KLHL3, kotransfekcija p.Arg- 431Trp KLHL3 dovela je do povećanih razina proteina WNK4, za koje se pretpostavlja da uzrokuju povećanu reapsorpciju NaCl putem nosača osjetljivog na tiazide i PHA II.
Zaključci: Čak i kod bolesnika koji se javljaju u kasnoj dobi i kod prisutnosti KBB-a, treba posumnjati na PHA II ako su razine renina niske, a hiperkalijemijska acidoza i hipertenzija nisu primjerene za stadij KBB-a, osobito u prisutnosti sumnjive obiteljske anamneze.
Uvod
Sistemska arterijska hipertenzija pogađa više od 1,1 milijarde odraslih osoba u svijetu [1] i smatra se najvažnijim promjenjivim čimbenikom rizika za sveukupni morbiditet i mortalitet u svijetu [2]. Približno 90% odraslih bolesnika ima takozvanu primarnu ili esencijalnu hipertenziju s multifaktorijalnom etiologijom genskog okruženja [2], dok se u ostatku može identificirati temeljni uzrok hipertenzije. Česti uzroci sekundarne hipertenzije su primarni aldosteronizam, opstruktivna apneja u snu, parenhimska bubrežna bolest i stenoza renalne arterije [3]. U rijetkim slučajevima, hipertenzija se nasljeđuje kao monogenska osobina. Oboljeli pacijenti obično imaju niske razine renina u plazmi, dok razine aldosterona i elektrolita variraju ovisno o temeljnoj etiologiji [4]. Mendelski oblici hipertenzije često se manifestiraju u djetinjstvu ili mladosti. Odrasli se rijetko ispituju na monogensku hipertenziju; stoga njegova prevalencija u općoj populaciji ostaje nepoznata. U odabranoj kohorti (kriteriji za uključivanje najmanje jedan od: dob na početku Manje od ili jednako 35 godina, rezistentna hipertenzija, hipertenzija s abnormalnostima elektrolita, hormonalne abnormalnosti, abnormalni slikovni rezultati ili sugestivni klinički znakovi), pregledano je 37 gena kandidata, a patogene ili vjerojatno patogene varijante identificirane su u 33 od 1179 slučajeva (2,8%) [5].
Ova se studija usredotočuje na pseudohipoaldosteronizam tipa II (PHA II), oblik Mendelove hipertenzije koji karakterizira hiperkalijemijska acidoza i niske razine renina u plazmi [6]. PHA II je također poznata kao obiteljska hiperkalemijska hipertenzija. Prvi put su ga 1964. opisali Paver i Pauline kod mladog muškarca s teškom hipertenzijom i hiperkalemijom unatoč inače normalnoj bubrežnoj funkciji [7], kojeg su Stokes i suradnici [8] te Arnold i Healy [9] dodatno okarakterizirali i pokazali da ima nizak renin u plazmi. Nakon izvješća o 10-godišnjoj djevojčici s niskim stasom, hipertenzijom, teškom hiperkalemijom, blagom acidemijom, periodičnom paralizom i potisnutim reninom 1970. godine od strane Gordona i sur. [10], sindrom se povremeno naziva i Gordonov sindrom.
Godine 2001. mutacije u genima bez lizina (WNK) serin-treonin kinaze WNK1 i WNK4 identificirane su kao uzroci PHA II [11], te daljnje mutacije u KLHL3 (kodira kelch-like 3) i CUL3 (kodira geni cullin 3) opisani su 2012. [12, 13]. Subforme PHA II uzrokovane mutacijama u WNK1, WNK4 i CUL3 autosomno su dominantni poremećaji, dok se mutacije KLHL3 mogu naslijediti autosomno dominantno ili autosomno recesivno [12]. KLHL3 ima N-terminalnu BTB domenu, nakon koje slijedi BACK domena i C-terminalna struktura propelera sa šest lopatica koja se sastoji od takozvanih ponavljanja nalik kelchu (prikazano na sl. 1d, 2a). Dominantne KLHL3 mutacije grupiraju se unutar ili između lopatica propelera, dok su recesivne mutacije raspoređene po proteinu [12]. Recesivni slučajevi su rjeđi od dominantnih slučajeva; ukupno je objavljen 21 pacijent iz 14 obitelji s recesivnim KLHL3 mutacijama [12-15] (tablica 1).
Temeljna patofiziologija hipertenzije u PHA II je povećana reapsorpcija NaCl putem nosača osjetljivog na tiazide (Na-Cl cotransporter, NCCT) u distalnom zavojitom tubulu bubrega, a terapija tiazidima ispravlja i hipertenziju i abnormalnosti elektrolita u bolesnika s PHA II [16]. Ukratko, WNK1 i WNK4 fosforiliraju OSR1 (gen 1 koji reagira na oksidativni stres) i SPAK (Ste20-srodna kinaza bogata prolinom alaninom), koji zatim fosforiliraju i aktiviraju NCCT [17, 18]. KLHL3 je supstratni adapter ubikvitin ligaze CUL3; kompleks KLHL3-CUL3 ubikvitinilira WNK kinaze i tako potiče njihovu razgradnju [19]. Gubitak funkcije ubikvitin ligaze ili oslabljeno vezanje na WNK kinaze uzrokuje povećanu zastupljenost WNK, povećanu fosforilaciju NCCT [18] i povećanu apsorpciju NaCl u distalnom zavojitom tubulu. U kasnijim segmentima nefrona smanjena je reapsorpcija NaCl putem ENaC (epitelni natrijev kanal) i sekrecija K+ putem ROMK (vanjski kanal medularnog bubrega) [20, 21]. KLHL3 knockout miševi pokazuju hipoplaziju distalnog uvijenog tubula, snažno povećane razine WNK1 i WNK4 i povećanu fosforilaciju OSR1, SPAK i NCC u bubregu. Nadalje, pokazuju hiperkalemiju, hiperkloremiju i metaboličku acidozu [22]. Ovdje prikazujemo pacijenta s autosomno-recesivnim PHA II i karakteriziramo temeljnu genetsku mutaciju i patofiziologiju
Materijali i metode
Priprema DNK i Sangerovo sekvenciranje DNK je pripremljena iz uzorka periferne venske krvi pomoću QIAamp DNA Blood Maxi Kit (Qiagen) prema uputama proizvođača. Standardni PCR i izravno dvosmjerno Sangerovo sekvenciranje genomske DNA provedeno je pomoću objavljenih početnica za KLHL3 [13], WNK1 i WNK4 [11] i CUL3_9F (5′-AGGAGACACTTTCTCAAAACCG-3′) i CUL3_9R (5′-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC-3′) početnice za CUL3. Sangerovo sekvenciranje obavljeno je u Eurofins Genomicsu.
Usklađivanje sekvence
Homologne proteinske sekvence identificirane su pomoću NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) i baze podataka eggNOG (http://eggnogdb.embl.de). Prikazane sekvence uključuju ljudski KLHL3 i njegove ortologe: Homo sapiens (NP_059111.2), Mus musculus (NP_001349344.2), Gallus gallus (XP_015149442.1), Danio rerio (XP_021328460.1), Ciona intestinalis (XP_009862126.1), Drosophila melanogaster (NP_724095.1) i Caenorhabditis elegans (NP_001254310.1) . Ljudski paralozi identificirani su istraživanjem literature i uključuju KLHL1 do KLHL42 kao što je prikazano u online dodatnoj tablici 1 (za sav online suppl. materijal pogledajte www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [23]. Nizovi su poravnati pomoću Jalview verzije 2.10.5 [24]. Struktura domene je iz UniProta (Q9UH77, pristupljeno 13. travnja 2021.) i vizualizirana je pomoću DOG-a [25].
Plazmidi i mutageneza usmjerena na mjesto
Plazmidi pTRE2hyg WNK4 i pFN21A KLHL3 bili su ljubazni darovi dr. Shinichi Uchida (Tokyo Medical and Dental University). Za uvođenje mutacije p.R431W, početnice su dizajnirane pomoću Primera X (https://www.bioinformatics.org/primerx): 5′- GATGAACACGCGGTGGAGCAGTGTGG -3′ (KLHL3_ R431W{{10} }F) i 5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R). Mutantni ostaci prikazani su masnim slovima. Mutageneza usmjerena na mjesto provedena je pomoću kompleta QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit s PfuUltra visokovjernom DNA polimerazom (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SAD) prema uputama proizvođača. cDNA je Sanger-sekvencirana u Eurofins Genomics. Plazmidi su pripremljeni korištenjem QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kita.
Kultura tkiva, prolazna transfekcija i Western blot
COS7 stanice su uzgajane u DMEM + L-glutamin, 10% FBS i 1% penicilin/streptomicin (sve Gibco, Thermo Fisher). Za transfekcije, stanice su nasađene na 6-ploče s jažicama u gustoći od 1,9 × 105 stanica/jažici i uzgojene do približno 90% gustoće. Stanice su transficirane s 1 µg pTRE2hyg WNK4 i 2 µg pFN21A (prazni vektor ili KLHL3 divlji tip [WT]) ili KLHL3 R431W cDNA upotrebom Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) prema uputama proizvođača. Za transfekciju su korištena po dva neovisna klona. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, stanice su isprane u hladnom PBS-u i lizirane u 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA i 1% NP40 koji je sadržavao potpuni koktel inhibitora proteaze (Roche, Merck). Lizat je centrifugiran na 20,000 g 30 minuta na 4 stupnja, a supernatant je pohranjen na -20 stupnjeva. Koncentracije proteina određene su u duplikatu (standard) ili triplikatu (uzorci) BCA testom (Pierce, Thermo Fisher) prema uputama proizvođača. Oko 20 µg ukupnog proteina je frakcionirano pomoću SDSPAGE i preneseno na PVDF membranu (1,5 h, 100 V). Membrane su blokirane u 2% suhom mlijeku u TBST. Western blot je izveden pomoću poliklonalnog zečjeg anti-HaloTaga (Promega #G9281, 1:500, 4 stupnja preko noći), nakon čega je uslijedilo ispiranje i inkubacija s magarećim IgG anti-zečjim IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # {{46 }}, dianova, 1:20, 000, 1 h na sobnoj temperaturi), ispiranje i poboljšana kemiluminescentna detekcija (Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare). Mrlje su uklonjene pomoću ROTIFree Stripping Buffer 2.0 (Carl Roth), blokirane u 2% suhom mlijeku u TBST preko noći na 4 stupnja, i inkubirane s monoklonskim mišjim anti-FLAG M2 (SigmaAldrich #F1804, Merck, 1:1,{{69} }, 1,5 h na sobnoj temperaturi), nakon čega slijedi magareći IgG anti-mišji IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # 715-035-151, dianova, 1:20,000, 1 h na sobnoj temperatura), otkrivanje ECL-a, uklanjanje i blokiranje kao gore. Mrlje su zatim inkubirane s monoklonskim mišjim anti- -aktinom (Sigma-Aldrich # A2228, Merck, 1:5000, 1 h na sobnoj temperaturi) i magarećim IgG protiv mišjih IgG, nakon čega je ponovno uslijedila ECL detekcija. Trake su kvantificirane korištenjem softvera Image Lab na ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). Intenziteti traka detektiranih anti-HaloTag antitijelima i anti-FLAG M2 antitijelima podijeljeni su s odgovarajućim intenzitetima traka detektiranih anti- - aktin antitijelima. Kako bi se procijenile razine ekspresije KLHL3, stanice su transfektirane kao gore, ali korištenjem 0 µg, 0,5 µg, 1 µg, 2 µg, 4 µg i 8 µg pFN21A KLHL3 WT ili R431W. Gel elektroforeza i blotiranje su izvedeni kao gore. Za cikloheksimidni chase test, stanice su zasađene kao gore i transficirane kao gore, ali s 2 µg pFN21A KLHL3 WT ili 4 µg KLHL3 R431W. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, dodano je 100 uM cikloheksimida, a stanice su lizirane nakon naznačenih vremenskih točaka. Daljnji koraci analize bili su kao gore.
Slika 2. MD simulacije WT i p.Arg431Trp (R431W) KLHL3 Kelch domena. Pogled odozgo prema dolje Kelchove domene (PDBID: 4CH9), obojen lopaticama propelera (K1–K6). Mjesto mutacije označeno je žutom zvjezdicom, a područje od interesa obojeno je sivo (ostaci 425–465), a peptid WNK4 (nije uključen u simulacije) je proziran i obojen u sivo. b Razlika u MSF-ovima Kelchove domene mapirana na okosnicu proteina. Mjesto mutacije označeno je žutom zvijezdom. Crvena boja označava dinamičnije (manje stabilne) dijelove proteina. c RMSD cijelog proteina (gore), ostataka 425–465 (sredina) i WNK4-vezujućeg džepa (dno) iz kristalne strukture za tri neovisne replike simulacije (podebljane linije, tekući prosjeci). d Violinski dijagrami h veza (lijevo) i COM udaljenosti (u sredini) između K3 (ostaci 425–441) i K4 (442–465) - lopatice propelera i elektrostatika džepova vezivanja (desno). e Strukturni sloj sučelja K3–K4 od konačnog okvira (1,1 μs) svake replike (WT, plava; R431W, siva) s eksperimentalnim/početnim modelima (crna). Proteinska okosnica prikazana je kao crtani film, s ostatkom 431 prikazanim kao štapići. MSF, srednja kvadratna fluktuacija.
Simulacija molekularne dinamike
WT model temeljio se na rendgenskoj kristalnoj strukturi (PDBID: 4CH9) ljudske Kelchove domene u kompleksu s peptidnim fragmentom WNK4 [26]. Atomi koji nedostaju i terminalne kapice dodani su pomoću uslužnog programa psfgen u verziji 1.9.3 vizualne molekularne dinamike [27]. Mutant (R431W) KLHL3 model generiran je pomoću Modeller verzije 9.18 [28]. Konačni raspon ostataka za svaki sustav bio je 300–585. N- i C-krajevi modela WT i R431W neutralizirani su acetilacijom, odnosno N-metilamidacijom. Zadana protonacijska stanja dodijeljena su svakom titracijskom ostatku prema analizi s PROPKA verzijom 3.0 [29]. Peptid WNK4 uklonjen je iz simulacija proizvodnje zbog disocijacije od KLHL3 nakon početnih simulacija ravnoteže.
Sve su simulacije provedene pomoću softverskog paketa GROMACS verzija 2021 [30]. Parametri polja sile CHARMM36m korišteni su za atome proteina [31]. Ioni su opisani korištenjem zadanih CHARMM parametara, a za vode je korišten model TIP3P [32]. Integracijski vremenski korak od 1 fs korišten je za početni korak ekvilibracije, a 2 fs korištena su za sve sljedeće simulacije. Sve veze koje uključuju vodik ograničene su pomoću LINCS-a [33]. Nevezane Van der Waalsove interakcije izračunate su korištenjem Lennard-Jonesovog potencijala s graničnim polumjerom od 1,2 nm; sile su glatko isključene u rasponu od 1,2–1,0 nm. Sva elektrostatika izračunata je Ewaldovom metodom izglađene mreže čestica [34] s graničnom udaljenošću u stvarnom prostoru od 1,2 nm. Nakon početne simulacije u izohorno-izotermalnom ansamblu (NVT), sve naknadne simulacije izvedene su u izobarno-izotermalnom ansamblu (NPT) na temperaturi od 310,15 K pomoću termostata za reskaliranje brzine [35] s vremenskom konstantom od 0,5 ps. Termostat je primijenjen odvojeno na protein i otapalo (tj. vodu i ione); iste skupine korištene su za uklanjanje gibanja središta mase (COM). Tlak od 1 bara nametnut je pomoću barostata Berendsen [36] ili Parrinello-Rahman [37] na izotropan način s vremenskom konstantom od 5 ps.
Modeli WT i R431W solvatirani su u kubičnoj kutiji s početnim dimenzijama 1,2 × 1,2 × 1,2 nm3. Svaki sustav je neutraliziran s 150 mM NaCl. Nakon početnog minimaliziranja energije najvećeg pada, svaki sustav je uravnotežen u NVT skupu tijekom 5 ns s ograničenjima položaja na svim atomima proteina. Sljedeći korak ekvilibracije izveden je u NPT skupu tijekom 5 ns s istim ograničenjima kao u prethodnom koraku. Ograničenja položaja uklonjena su sa svih bočnih lanaca za konačnu 5-ns simulaciju ravnoteže. Tri početne strukture generirane su iz završne faze ekvilibracije za simulacije neovisne proizvodnje WT i R431W sustava sa svim uklonjenim ograničenjima položaja. Svaki proizvodni replikat simuliran je 1,1 µs; prvih 0,1 µs je uklonjeno iz analize.
Kako bi se procijenila strukturna stabilnost tijekom simulacija, izračunata su srednja kvadratna odstupanja (RMSD) od kristalne strukture za C atome cijelog proteina, kao i K3–K4 sučelje (ostaci 425–465) i WNK4- vezni džep (ostaci 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528 i 577). Izračunati su tekući prosjeci RMSD tragova i preklopljeni s neobrađenim podacima.
Učinak mutacije na strukturnu stabilnost vizualiziran je izračunavanjem razlike u srednjim kvadratnim fluktuacijama atoma proteina C, prosjekom okvira i replika i preslikavanjem na strukturu WT proteina. Sve vizualizacije proteina generirane su pomoću ChimeraX [38]. Učinak mutacije R431W na sučelje K3 (ostaci 425-441) do K4 (ostaci 442-465) karakteriziran je analizom vodikove veze (H-veza) i COM udaljenosti između dviju skupina. H-veze su procijenjene na svakom okviru pomoću GROMACS alata gmx hbond, s graničnim vrijednostima udaljenosti i kuta od 3,5 Å odnosno 30 stupnjeva. COM udaljenosti su procijenjene na sličan način za svaki okvir – distribucije i H veza i COM udaljenosti vizualizirane su kao dijagrami violine. Prosjeci su izračunati za putanje i replike.
Elektrostatika WNK{0}}veznog džepa izračunata je pomoću g_elpota [39]. Vremenski tijek elektrostatskog potencijala u veznom džepu procijenjen je definiranjem sferičnog volumena polumjera od 8 Å, sa središtem u geometrijskom središtu ostataka koji čine vezni džep. Za procjenu varijance u elektrostatici, izračunati su 50-ns blok prosjeci. Distribucija elektrostatskog potencijala unutar veznog džepa za mutant WT i R431W vizualizirana je kao dijagrami violine, s prosjecima izračunatim preko 50-ns blokova i putanja.
Usluga podrške Wecistanche-najvećeg izvoznika cistanche u Kini:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/telefon:+86 15292862950
Kupite za više pojedinosti o specifikacijama:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
