Konzervirana duga nekodirajuća RNA, GAPLINC, modulira imunološki odgovor tijekom endotoksičnog šoka

Za više informacija kontaktirajtedavid.wan@wecistanche.com

Značaj

Upala je uglavnom proučavana u kontekstu gena koji kodiraju proteine. Nedavne studije su otkrile IncRNA kao važne regulatore imuniteta. Funkcionalna karakterizacija ovih gena ostaje aktivno područje istraživanja. U ovoj studiji identificirali smo GAPLINC kao funkcionalno očuvanIncRNAizmeđu ljudi i miševa. Deplecija GAPLINC-a rezultira pojačanom ekspresijom gena imunološkog odgovora koji su izravniNF-kBmete. Zapanjujuće, primijetili smo da Gaplinc nokautirani miševi pokazuju otpornost na endotoksični šok izazvan LPS-om i otkrivamo da bazalna ekspresija upalnih gena sprječava stvaranje točkica radi zaštite od zatajenja više organa i smrti. Ova otkrića imaju implikacije u liječenju sepse, u kojem nove terapije usmjerene na IncRNA mogu doprinijeti vrijednim informacijama u razumijevanju upale i poboljšanju ishoda pacijenata.

Kliknite ovdje da saznate više o Cistancheu

FG 1. identifikacija i karakterizacija specifičnih za makrofageIncRNA GAPLINC. (A) A schematic for macrophage differentiation in vitro using primary human celeb or immortalized THP-1 cells, Isolated monocytes from human P8MCs are differentiated into macrophages using recombinant magnon stimulating factor. PHP-1 cells are differentiated into macrophages by treatment with PMA (100 nM). (8)RNA-Seg analysis on macrophages differentiated from monocytes isolated from human PBMCs (n = 4 donors). Results are represented in a volcano plot. GAPUNC (shown in red) is the most up-regulated and RNA (>1,000-fok). (C) RNA-Seq analizaGAPLNCekspresije tijekom diferencijacije monocita u makrofage za naznačene vremenske točke. GAPLINC ekspresija je predstavljena kao kopije po stanici (FPKM. (D) Toplinska karta predstavlja ekspresiju gena iz prilagođene ploče Nanostring, koja prikazuje 10 najboljih različito eksprimiranih InciNA uspoređujući monocite i makrofage u primarne ljudske stanice i THP-1 stanice. Podaci iz Nanotringa izvedeni su u biološkim duplikatima. (E) Shema za granulocitno-monocitne progenitorske stanice koje stvaraju dvije različite populacije; 1) MDDC i 2) MDM. Trag preglednika genoma UCSC prikazuje očitavanja RNA-Seq iz monocita, makrofaga i dendritičnih stanica naGAPLINCmjesto. () qPCR analiza RNA pročišćenih iz nuklearnih (bijelih) i citoplazmatskih (sive) frakcija u MDM-ima (G qPCR analiza Russa izoliranog iz različitih frakcija polisoma MDM sustava (10 do 50 posto gradijenta saharoze, SW41, 40 K okr/min, za ~ 1,5 h).

Nedavne studije identificirale su tisuće dugih nekodirajućih RNA (ncRNA) u genomima sisavaca koji reguliraju ekspresiju gena u različitim biološkim procesima. Iako su IncRNA identificirane u raznim imunološkim stanicama i uključene u imunološki odgovor, biološka funkcija i mehanizam većine ostaju neistraženi, osobito kod sepse. Ovdje utvrđujemo ulogu hdRNA-prediktivne dugačke intergene nekodirajuće RNA (GAPLINC) želučanog adenokarcinoma-prethodno karakterizirane po svojoj ulozi u raku, sada u kontekstu urođenog imuniteta, makrofaga i endotoksičnog šoka izazvanog LPS-om. Analiza transkriptoma makrofaga iz ljudi i miševa otkriva da je GAPLINC očuvana IndRNA koja je visoko izražena nakon diferencijacije makrofaga. Nakon upalne aktivacije, GAPLINC se brzo snižava. Makrofagi osiromašeni GAPLINC-om pokazuju pojačanu ekspresiju upalnih gena na početku, dok prekomjerna ekspresija GAPLINC-a potiskuje ovaj odgovor. U skladu sa stanicama osiromašenim GAPLINC-om, Gaplinc nokautirani miševi pokazuju povećane bazalne razine upalnih gena i otpornost naLPS-induciranendotoksični šok. Mehanički gledano, preživljavanje je povezano s povećanim razinama nuklearnog NF-xB u Gaplinc nokaut miševa koji pokreću bazalnu ekspresiju ciljnih gena koji se obično aktiviraju tek nakon upalne stimulacije. Pokazujemo da ova aktivacija gena imunološkog odgovora prije izazivanja LPS dovodi do stvaranja krvnog ugruška u de-areas, koji štiti Gaplinc nokaut miševe od zatajenja više organa i smrti. Zajedno, naši rezultati identificiraju prethodno nepoznatu funkciju GAPLINC-a kao negativnog regulatora upale i otkriti ključnu ulogu ove lncRNA u modulaciji endotoksičnog šoka.

sl.2. GAPLINC je negativni regulator upale i ovisi o Nf-sB signalizaciji. Monociti izolirani iz ljudskih PBMC i diferencirani u makrofage transficirani su kontrolnom ili GAPLINC siRNA. (A)RNA-Seqanalizana GAPLINC kd ili kontrolnim siRNA MDM-ovima. RNA-Seq je izveden u biološkim duplikatima. Rezultati su prikazani u dijagramu vulkana. Značajno pojačano regulirani geni s promjenom puta većom ili jednakom 2 uokvireni su crvenom bojom. (6) GO-Term analiza značajno pojačano reguliranih gena. (C) Toplinska karta predstavlja gensku ekspresiju vrhunskih gena povezanih s imunološkim sustavom koji su regulirani naviše na GAPLINC kd. Podaci iz RNA-Seq izvedeni su u biološkim duplikatima. (D)GAPLINC izoforme u MDM-ima određene su R2C2 sekvenciranjem na bazi nanopora. Podaci iz Nanopore sekvenciranja izvedeni su u biološkim duplikatima (neobrađeni podaci dostupni su na SRAunder Bloproject PRINA639136). (E) Tablica koja predstavlja broj očitanja i postotak svake GAPLINC izoforme. (F) Dvosmjerni vektor koji eksprimira GFP-zetocin s jedne strane i GAPLINC s druge strane. (G i H) qPCR analiza ekspresije GAPLINC u THP-1 stanicama koje eksprimiraju ektopični GAPLINC ili kontrolu praznog vektora. Razine IL6 su kvantificirane nakon stimulacije s LPS (200 nal mL) tijekom 6 h; podaci su skupljeni iz tri neovisna eksperimenta.*P<0.05. ()="" rna-seq="" analysis="" of="" mdms="" stimulated="" with="" lps(200="" ng/ml)="" for="" the="" indicated="" time="" points.="" data="" from="" rna-seq="" was="" performed="" in="" biological="" duplicates.="" galplinc="" expression="" is="" represented="" as="" copies="" per="" cell="">FPKM), U qPCR analiza GAPLINC-a u MDM-ovima （n=3）tretiranim s DMSO ili BAY-7082（10μM）, nakon čega slijedi LPS stimulacija （200 ngmL） za 6 ht podaci su prikupljeni iz tri neovisna eksperimenta. *P<0.05. (k)atacseq="" analysis="" of="" monocytes="" and="" macrophages,="" untreated="" and="" treated="" with="" lps="" (200="" ng/ml)="" for="" 1,6,="" and="" 18h.ucsc="" browser="" track="" displays="" atac-seq="" reads="" at="" the="" gaplinc="">

sepsa je po život opasna bolest uzrokovana pretjeranom reakcijom tijela na prisutnost infekcije, što može brzo dovesti do zatajenja više organa i smrti. Imunološki sustav ključan je u pružanju zaštite od infekcije; međutim, nekontrolirana aktivacija može imati ozbiljne posljedice za domaćina. Prema Centrima za kontrolu i prevenciju bolesti, jedan od tri pacijenta koji umru u bolnici ima sepsu(1). a ipak još uvijek ne razumijemo temeljne molekularne mehanizme koji dovode do smrtnosti. Kliničke opcije za liječenje sepse ograničene su na davanje tekućine, antibiotike i suportivnu njegu i ostale su uglavnom nepromijenjene desetljećima. Iako su rana dijagnoza i brzo liječenje poboljšali ishode sepse (2), postoji kritična potreba za razvojem novih terapija. Iako su istraživanja ekspresije gena provedena kako bi se ispitali potencijalni terapeutski ciljevi za sepsu, ti ciljevi ostaju uglavnom neobilježeni (3). Identificirali smo dugu nekodirajuću RNA (lncRNA) s ulogama u kontroli imunološkog odgovora i endotoksičnog šoka koja pruža puteve za razvoj novih lijekova za ciljanje sepse.

Proizlaziti

Slika 3. GAPLINC je sačuvan u miševa i regulira odgovor na endotoksični šok. (4) GAPLINC je očuvan u sinteniji. GAPLINC se nalazi na Chr18 kod ljudi i na Chr17 kod miševa, između gena za kodiranje proteina Dlgap1 i Gift. Dlgapil nije izražen umakrofagi. (B)MCA prikazuje distribuciju razina Gaplinca u različitim tipovima imunoloških stanica (BM). (C) qPCR analiza Gaplinc ekspresije u B stanicama i BMDM-ovima; ovi podaci (srednja vrijednost ± SD) reprezentativni su za tri neovisna eksperimenta, (D) qPCR analiza Gaping ekspresije u BMDME stimuliranom LPS-om (200 na/mL) tijekom 6 sati; ovi podaci (srednja vrijednost ±SD) reprezentativni su za tri neovisna eksperimenta. (E) Shema Gaplinc lokusa prije i nakon CRISPRCas9 posredovane delecije. Isprekidane linije označavaju približno područje brisanja. Gel predstavlja PCR amplificiranje genomskih podataka. Duljine amplikona su uspoređene za WT i Gaping KO miševe, (F) qPCR analiza Gaplinc ekspresije u WT i Gaplinc-KO BMDM-ovima korištenjem kombinacije početnica za otkrivanje Exon1, Exon2 i regija Gaplinc transkripta koje se protežu na egzone; ovi podaci (srednja vrijednost ± SD) reprezentativni su za tri neovisna eksperimenta. (G)RNA-Seq analiza u BMDMs iz WT i Gaplinc KO miševa (n =3). Rezultati su prikazani u dijagramu vulkana. Značajno pojačano regulirani geni s promjenom puta većom ili jednakom 2 prikazani su crvenom bojom. (H) GO-Term analiza značajno pojačano reguliranih gena. (I i J) Prikazani su podaci o preživljenju WT i Gaplinc KO miševa kao odgovor na izazov E. coli LPS (5 mg/kg/mišev) (n =6 do 10). Statistički test razlika izračunat je pomoću log-rank (Mantel-Cox) testa. "...P< 0.001.="" changes="" in="" body="" temperature="" of="" wt="" and="" gapline="" ko="" mice="" were="" recorded="" at="" the="" indicated="" time="" points.="" (k)="" survival="" data="" of="" wt="" and="" gaplinc="" ko="" mice="" are="" shown="" in="" response="" to="" the="" e.="" coli="" lps="" challenge(20="" mg/kg/mice)(n="10)." the="" statistical="" test="" of="" differences="" was="" calculated="" using="" the=""><>

Budući da ekspresija lncRNA može regulirati imunološki odgovor utječući na diferencijaciju imunoloških stanica i njihovu odgovarajuću funkciju (4-7), htjeli smo istražiti ulogu ncRNA u makrofagima. Makrofagi su važne urođene imunološke stanice koje se mogu izvesti iz monocita i kritične su za prepoznavanje patogena korištenjem Toll-like receptora (TLR).Nakon aktivacije. TLR pokreću složene signalne putove koji aktiviraju ključne faktore transkripcije kao što je NF-kB. što dovodi do transkripcije stotina gena imunološkog odgovora (8).

Kako bismo identificirali IncRNA uključene u diferencijaciju i funkciju makrofaga, proveli smo sekvenciranje RNA (RNA-Seq)u ljudskim primarnim makrofagima izvedenim iz monocita (MDM) i monocitnoj staničnoj liniji THP-1s (Slika 1A i Dodatak SI. Slika S1). Identificirali smo prediktivnu dugu intergensku nekodirajuću RNK (GAPLINC) želučanog adenokarcinoma kao IncRNA koja se najviše regulira tijekom diferencijacije monocita u makrofage (slika 1B). Razine GAPLINC-a mogle su se detektirati do 1. dana i porasle su na ~300 kopija po stanici (Slika 1C). Koristeći tehnologiju profiliranja RNA (nCounter, Nanostring), potvrdili smo GAPLINC kao jednu od 10 najboljih mRNA izraženih u diferenciranim primarnim MDM-ovima i THP-1s (Slika 1D). Također smo potvrdili da je GAPLINC visoko eksprimiran u MDM-ima, ali nije eksprimiran u dendritskim stanicama koje potječu iz monocita (MDDC) bliskog tipa stanice (Slika 1E), što sugerira da je ekspresija GAPLINC-a specifična za stanični tip. Izvođenjem eksperimenta frakcioniranja stanica i mjerenjem razina GAPLINC-a u citoplazmatskim i nuklearnim odjeljcima makrofaga pomoću qPCR-a, otkrili smo da je GAPLINC pretežno lokaliziran u citosolu u usporedbi s CD14, citoplazmatskom mRNA, i NEAT1, nuklearnom IncRNA (Sl. 1F). To je u skladu s nalazima u stanicama raka, u kojima je GAPLINC uglavnom lokaliziran u citoplazmi (9). Kako bismo osigurali da GAPLINC nije kodirajući, izvršili smo profiliranje polisoma, metodu koja se koristi za analizu je li gen aktivno preveden u protein. Za razliku od CD14, ni NEATI ni GAPLINC nisu pronađeni u frakciji s visokim udjelom polisoma, što sugerira da GAPLINC nije preveden (Slika 1G),

sl.4. Gaplnc KO pojačava IRG i pokazuje povećanu razinu p65 u golom na početku. (A) Razine citokina u serumu WT i Gaplinc KO miševa na bazal.n=4 do 7,*P<0.05.(b and="" c)rna-seg="" analysis="" in="" bmdms="" from="" wtand="" gaplinx="" ko="" mice="" stimulated="" with="" lps="" (200naiml)for6h="" (n="3)." the23aenes="" up-regulated="" in="" gap/inc="" ko-only="" condition="" are="" compared="" to="" wt="" and="" gapfinc-ko="" bmdms="" stimulated="" with="" lps.="" the="" resulting="" fold="" change="" upon="" lps="" stimulation="" is="" shown="" for="" wt="" and="" gapinc-ko="" bmdms.genes="" are="" ranked="" according="" to="" their="" fold="" change="" in="" wt.="" (d)="" coagulation="" parameters="" assessed="" for="" wt="" and="" gapinc="" ko="" mice="" challenged="" ip.with="" e.="" coils(5mg/kg/mice)(n="4" to="" 5).plasma="" was="" collected="" 18h="" post-lpsiniection.="" aptt="" was="" measured.="" (e)genes="" upregulated="" non="" sirna="" kd="" of="" human="" gaplnc="" in="" mdms="" are="" compared="" to="" genes="" up-regulated="" upon="" crsprcas9="" knockout="" of="" mouse="" gaplincin="" bmdms="" (fold="" change="" ≥1.5).="" up-regulated="" genes="" overlapping="" in="" both="" humans="" and="" mice="" are="" shown="" in="" the="" middle.="" (f)="" western="" blot="" of="" kb-gin="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" at="" the="" indicated="" time="" points="" following="" stimulation="" with="" lps="" (200="" ngml);="" these="" data="" are="" representative="" of="" three="" independent="" experiments,(g)="" western="" blot="" of="" p65="" in="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="3)" at=""><0.01. (h="" western="" blot="" of="" p65="" in="" the="" nuclear="" fraction="" of="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="">

Zatim smo istražili učinak utišavanja GAPLINC-a na diferencijaciju makrofaga. Kako su se razine GAPLINC-a povećavale tijekom diferencijacije, pretpostavili smo da će GAPLINC knock-down (KD) utjecati na gene uključene u diferencijaciju. Koristeći skupnu malu interferirajuću RNA (siRNA), postigli smo ~55 do 65 posto kd GAPLINC-a u primarnim MDM-ovima (SIAdodatak, slika S2). Proveli smo RNA-Seq i identificirali niz gena koji su bili disregulirani nakon GAPLINC kd (Slika 24). Potvrdili smo najveće pogotke pomoću Nanostringa (SI dodatak, slika S3). Analiza obogaćivanja genske ontologije (GO) pokazala je da su geni imunološkog odgovora značajno prekomjerno zastupljeni u genima koji su regulirani prema gore na GAPLINC kd, a ne u genima koji su uključeni u diferencijaciju makrofaga, suprotno našoj izvornoj hipotezi. (Slika 2B). Naime, različito izraženi geni u GAPLINC-KD stanicama uključuju proupalne citokine i kemokine (IL6, CXCL10 i TNFSF10), IFN-stimulirane gene (ISG) (IFIT2 i RSAD2) i proteine ​​koji vežu gvanilat (GBP) (GBP3 i GBP5) (Slika 2C i SI Dodatak. Slika S4). Kako bi se potvrdilo da GAPLINC kd nije utjecao na diferencijaciju makrofaga. razine CD11B.CD16 i CD14 izmjerene su u kontrolnim i signalno tretiranim makrofagima i utvrđeno je da su slične (SI Dodatak. Slika S5). Zatim smo koristili dodatni kd pristup koristećiCRISPRinhibicija (CRISPRi) za ciljanje mjesta početka transkripcije pomoću GAPLIN-a korištenjem triju različitih vodiča RNA (gRNA) u THP-1 stanicama stimuliranim forbol 12-miristat 13-acetatom (PMA). Postigli smo više od 80 posto kd GAPLINC-a i ponovno promatramo povećanu ekspresiju proupalnog citokina IL6 kada je GAPLINC oboren na početnoj razini (SI Dodatak. Slika S6 A i B). Zanimljivo je da su nakon aktivacije lipopolisaharida (LPS) razine IL6 bile slične u kontrolnim u odnosu na GAPLINC kd THP-1 stanice (SIAdodatak, slika S6C). Budući da se osnovne razine razlikuju, ukupna višestruka indukcija IL6 smanjena je kada se GAPLINC ukloni. (S7 dodatak, slika S6D).

Kako je GAPLINC kd rezultirao pojačanom regulacijom gena imunološkog odgovora, generirali smo staničnu liniju THP-1 koja prekomjerno eksprimira GAPLINC kako bismo utvrdili posreduje li suprotan učinak. Korištenje dugotrajnih podataka sekvenciranja. identificirali smo dominantne izoforme GAPLINC izražene u MDM (slika 2D). Najzastupljenija izoforma, koja odgovara oznaci gena referentne sekvence (RefSeq), ugrađena je u naš konstrukt (slika 2E). Upotrijebili smo lentivirusni vektor koji sadrži dvosmjerni promotor za usporedni pogon zelenog fluorescentnog proteina (GFP)/zeocina i GAPLINC-a (slika 2F). Pomoću qPCR-a potvrdili smo da je GAPLINC bio stabilno izražen u THP-1s u usporedbi s kontrolom (Slika 2G). Prekomjerna ekspresija GAPLINC-a smanjila je IL6 na razini RNA u usporedbi s kontrolom nakon stimulacije s LPS-om, komponentom gram-negativnih bakterija (Slika 2H). Ova opažanja sugeriraju da GAPLINC djeluje kao negativni regulator upalnog odgovora.

Zatim smo ispitali razine GAPLINC-a u primarnim MDM-ovima kao odgovor na upalu. Nakon stimulacije LPS-om, otkrili smo da je GAPLINC brzo smanjen (Slika 2I). Dodatno, korištenjem qPCR-a pokazujemo da je GAPLINC također reguliran naniže nakon aktivacije različitimTLRligandi (Dodatak SI, slika S7A). Potvrđena je indukcija pozitivnih kontrolnih upalnih gena TNF-a, IL6 i CCL5 (SI dodatak, slika S7B). Ovi podaci sugeriraju da ekspresija GAPLINC-a mora biti smanjena nakon stimulacije kako bi došlo do optimalne indukcije gena upale. Kako bi se procijenila uloga NF-kB u kontroli ekspresije GAPLINC-a, MDM-ovi su prethodno tretirani dimetil sulfoksidom (DMSO) ili BAY11-7082, inhibitorom NF-B,

followed by stimulation with LPS for 6 h.In BAY11-7082-treated MDMs.the down-regulation of GAPLINC was impaired relative to control(Fig. 2/). which suggests the regulation of GAPLINC is dependent on NF-KB signaling. Induction of positive-control inflammatory genes TNF- and IL6 upon LPS stimulation was confirmed (SIAppendix, Fig, S7C).To understand how GAPLINC is being regulated, we utilized Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing(ATAC-seq)in MDMs to assess chromatin accessibility of the GAPLINC locus. We found that GAPLINC is actively transcribed in resting macro-phages but tightly shut down following LPS stimulation (Fig. 2K), suggesting that GAPLINC is regulated at the level of transcription.

Istražiti očuvanje GAPLINC-a između ljudi i miševa. nastojali smo identificirati sinteničke lokuse, u kojima su geni poziciono očuvani između ista dva gena za kodiranje proteina. nakon čega slijedi procjena funkcionalne očuvanosti. Ovdje pokazujemo da je Gaplinc položajno očuvan, locirajući transkript između gena Dlgap1 i TgifI (Slika 3A). Kako bismo potvrdili specifičnost tipa stanice, upotrijebili smo Atlas mišjih stanica (MCA)

(10) kako bi procijenili razine transkripta u imunološkim stanicama u koštanoj srži (BM) i otkrili da je najviše izražen u makrofagima, s nižim razinama ekspresije u neutrofilnim progenitorima (slika 3B). Dalje, kako bismo utvrdili jesu li obrasci ekspresije očuvani tijekom diferencijacije makrofaga i kod ljudi i kod miševa, izveli smo RNA-Seq uspoređujući BM stanice s makrofagima koji potječu iz koštane srži (BMDM), dovršili sklapanje de novo transkripta i otkrili da su razine mišjeg Gaplinca povećane nakon diferencijacije (SI dodatak, slika S8A). To smo potvrdili pomoću qPCR-a, uspoređujući razine Gaplinc u BM stanicama s BMDM (slika 3C). Usporediv s ljudskim GAPLINC-om. mišji Gaplinc se brzo smanjuje u BMDM-ovima stimuliranim LPS-om (Sl. 3D). Kao kontrolu, potvrdili smo indukciju upalnih gena The-a i I6 (SI Dodatak. Slika S8B). Mišji Gaplinc se također brzo smanjuje nakon aktivacije različitim TLR ligandima. Također je potvrđena indukcija gena pozitivne kontrole ll6 i Ccl5 (Dodatak SI, slika S8C).

Koristeći CRISPR, generirali smo Gaplinc nokaut (KO) miša u kojem su ekson I i većina prvog introna uklonjeni (slika 3E). Chaplin KO miševi razmnožavali su se normalno i nisu pokazivali očite nedostatke u razvoju. Brisanje Gapline potvrđeno je PCR amplifikacijom genomske DNA u divljeg tipa (WT) i Gaplinc KO miševa, s veličinama amplikona ~1300 bp za WT i ~500 bp za Gaplinc KO miševe (Slika 3E), potpuna strategija genotipizacije za potvrdu WT i Gaplinc KOs istaknuto je u SI dodatku, sl. S9. Također smo potvrdili nedostatak Gaplinca u BMDMs pomoću qPCR (Slika 3F). Kako bismo procijenili je li nedostatak Gaplinca utjecao na diferencijaciju, obojali smo WT i Gaplinc-KO BMDM za CD11B i F4/80; obrasci bojenja bili su slični, što ukazuje na normalnu diferencijaciju makrofaga (SI dodatak, slika S104). Kako bismo procijenili je li Gaplinc KO poremetio funkciju makrofaga, usporedili smo aktivnost fagocitoze u WT i Gaplinc-KO BMDM i nismo pronašli razlike (SI Dodatak, Slika S10B).

Kako bismo procijenili globalni utjecaj nedostatka Gaplinca u makrofazima, izveli smo RNA-Seq na WT i Gaplinc-KO BMDM; oboje nisu bili tretirani i LPS je stimuliran 6 sati. U Gaplinc-KO BMDM, ekspresija 23 gena (prikazana crvenom bojom. Slika 3G) bila je značajno pojačano regulirana na početku. Ovi geni uključuju proupalne citokine i kemokine (Il6.l1-a. I1-8 i Cxd10), ISGs (Ifitlbl1), članove GBP-obitelji (Gbp5 i Gbp0) i markeri stanične površine specifični za aktivirane makrofage (Cd69). GO analiza potvrdila je da su geni uključeni u imunološki odgovor previše zastupljeni u Gaplinc-KO BMDM na početku (Slika 3H). Ti su geni obično pojačano regulirani nakon stimulacije LPS-om (Dodatak SI. Slika S11). Slično podacima dobivenim iz naših studija na ljudima, ovi podaci sugeriraju daGAPLINCje funkcionalno očuvan među vrstama kako bi bazalno kontrolirao ekspresiju gena za upalni odgovor (IRG). Nije bilo veće razlike u genima koji su bili pojačano regulirani nakon stimulacije LPS-om između WT i Gaplinc-KO BMDM (Skup podataka S1).

Brojne studije pokazale su sposobnost IncRNA da reguliraju transkripciju susjednih gena (11). Kao takvi, istražili smo potencijalne cis-regulatorne uloge za Gaplinc budući da je njegov susjedni gen, Tgif1, prethodno bio uključen u modulaciju aktivacije makrofaga (12). Koristeći naše RNA-Seq podatke, potvrdili smo da u GaplincKO BMDM ekspresija Tgifl u odnosu na T stanice nije bila pogođena (SIAppendir.Sl.S124). Nadalje smo qPCR-om potvrdili da je Tgifl bio nepromijenjen u Gaplinc-KO BMDM (SI dodatak, slika S12B). Zatim smo istražili mogućnost da bi poremećaj Gaplinc lokusa mogao ukloniti važan regulatorni element, kao što je pojačivač. Iskoristili smo ATAC-seq podatke iz WT BMDM-ova za procjenu transkripcijski aktivnih regija u Gaplinc lokusu (13). Nismo identificirali signale unutar Gaplinc regije brisanja, samo one koji odgovaraju Gaplinc promotoru (SI Dodatak. Slika S13). Zajedno, ovi podaci sugeriraju da pojačana regulacija IRG-a nakon nedostatka Gaplinca nije posljedica učinaka na susjedne gene ili uklanjanja regulatornog elementa.

Kako Gaplinc KO u BMDM pojačava ekspresiju IRG-a u bazalnim uvjetima, željeli smo in vivo izazvati Gaplinc KO životinje da promatraju razlike u odgovoru domaćina. Koristili smo model "endotoksičnog šoka". u kojem je Escherichia coli LPS intraperitonealno (ip) ubrizgan WT i Gaplinc KO miševima kako bi se izmjerile razlike u preživljavanju. U dozi od 5 mg/kg/miš. WT miševi su pokazali 0 posto preživljenja nakon 2 dana (Slika 30. Međutim, 100 posto Gaplinc KO miševa je preživjelo, sg-pokazujući da Gaplinc KO miševi imaju otpornost na endotoksični šok izazvan LPS-om (Slika 31). Posebno uočene su značajne temperaturne razlike između WT i miševa s nedostatkom Gaplinc (Slika 3). Čak i kada se koristi mnogo veća doza LPS-a od 20 mg/kg, miševi s nedostatkom Gqplinc pokazuju značajnu prednost u preživljavanju (Slika 3K). Zajedno ovi podaci pokazuju da Gaplinc igra važnu ulogu u regulaciji imunološkog odgovora in vivo.

Iz naših studija na ljudima znamo da GAPLINC može regulirati imunološke gene na početku. Iako nema razlike u ekspresiji citokina nakon upalne aktivacije, postoji razlika u veličini odgovora budući da se osnovne razine razlikuju. Stoga, kako bismo bolje razumjeli ove razlike u preživljavanju in vivo, procijenili smo promjene u ekspresiji citokina na početku. Koristili smo multipleksirani niz citokina za istovremeno mjerenje biomarkera povezanih s imunološkim odgovorom, sepsom i rakom. Na početku, ključni imunološki geni uključujući MDC. MIP-1a.IL-13. IL-5. i M-CSF je bio značajno povišen u serumu Gqplinc KO miševa u usporedbi s WT (Slika 44). Ovi citokini uključeni su u regrutiranje stanica: međutim, koristeći protočnu citometriju, potvrdili smo da je postotak neutrofila, T stanica, B stanica, eozinofila, monocita i makrofaga bio usporediv između WT i Gaplinc KOmice na početku (SI Dodatak, Slika S14) . Zanimljivo je da su ti postoci također bili usporedivi s izazovima nakon LPS-a u vremenskim točkama od 6 h i 18 h (Dodatak SI, slike S15 i S16). Nadalje, serum miševa WT i Gaplinc KO testiran na kliničke značajke sepse, uključujući laktat i C-reaktivni protein (CRP) (Dodatak S7, slika S17), nije pokazao razlike

Kako je prethodno okarakterizirano da povećane razine MDC-a ili IL-13 (Slika 44) imaju zaštitnu ulogu protiv endotoksičnog šoka kroz modulaciju proupalnih citokina (14,15), zatim smo ispitali razlike u razinama proupalnih citokina , uključujući l6, Il1-, l1- i Cxcl10, nakon upalne aktivacije. Dok su razine WT i Gaplinc KO iste i na razini prijepisa (Slika 4B) i na razini proteina (Dodatak SI, Slika S18A-C), veličina promjene mnogo je niža (Slika 4C), što sugerira da je ovaj smanjeni puta promjena može igrati ulogu u sprječavanju osjetljivosti Gaplinc KO miševa na LPS. inducirani endotoksični šok.

Zajedno s neobuzdanom proizvodnjom citokina. drugi klinički aspekt endotoksičnog šoka koji može dovesti do smrti je stvaranje krvnih ugrušaka u manjim krvnim žilama, što dovodi do zatajenja više organa (16.17). Kako bismo to riješili, analizirali smo serum miševa tretiranih LPS-om ip. kako bismo procijenili razlike u koagulaciji. Korištenjem testa aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (a) koji mjeri vrijeme do stvaranja ugruška, otkrili smo da WT miševi pokazuju značajno produljeno vrijeme u usporedbi s Gaplinc KO miševima nakon izlaganja LPS-om (Slika 4D). Produljena vremena aPTT-a sugeriraju da su WT miševi već bili podvrgnuti koagulaciji i iscrpljenim ključnim faktorima koagulacije, tako da je u vrijeme testiranja, pokretanja zgrušavanja i mjerenja vrijeme do stvaranja ugruška povećano. Podaci sugeriraju da su razlike u preživljavanju nakon izlaganja LPS-u uzrokovane WT miševima koji su podvrgnuti povećanom zgrušavanju, što dovodi do eventualnog zatajenja organa i smrti.

Zatim smo pokušali mehanički razumjeti kako Gaplinc posreduje u ovom učinku. Prvo smo potvrdili njegovu lokalizaciju i analizirali razine Gaplinca u citoplazmatskim i nuklearnim odjeljcima BMDM-a pomoću qPCR-a. Slično ljudskom GAPLINC-u. mišji Gaplinc bio je pretežno citoplazmatski (ST dodatak, slika S19). Zatim smo izveli modificiranu sveobuhvatnu identifikaciju RNA-vezujućih proteina (ChIRP), u kombinaciji s masenom spektrometrijom i malim RNA sekvenciranjem, budući da je prethodno pokazano da GAPLINC stupa u interakciju s mikro RNA (18). Nismo uočili interakcije s prethodno identificiranim ciljevima (SIAdodatak, slika S20).

Budući da nismo mogli identificirati izravnog partnera za vezanje, usredotočili smo se na očuvanu funkciju između ljudi i miševa, posebno na očuvane gene zahvaćene našim studijama GAPLINC kd kod ljudi i Gaplinc KO kod miševa, od kojih su većina NF-kB regulatori (Slika 4E). ). Najzastupljeniji oblik NF-KB aktiviran LPS-om je heterodimer p65:p50, a sedam od devet očuvanih gena su izravne mete p65 (19). Koristili smo nativnu RNA imunoprecipitaciju (RIP) i pokazali da ne postoji izravna interakcija između Gaplinca i p65 (S7 dodatak, slika S21). U klasičnom NF-kB signalnom putu, podjedinice p6:p50 nalaze se u citosolu i vezane su na inhibicijski I-kB- u stanicama u mirovanju. Nakon aktivacije, I-KB- se razgrađuje, dopuštajući p65:p50 da se translocira u jezgru i aktivira ciljne gene (20). U WT i Gaplinc-KO BMDM-ovima, izmjerili smo degradaciju I-kB- pomoću Western blota i nismo pronašli razlike (Slika 4F). Zatim smo usporedili ukupne razine p65 u BMDM-ovima. U našim RNA-Seg podacima, razine transkripta p65(RelA) u bazalnim i LPS stimuliranim uvjetima za WT i Gaplinc-KO BMDM su usporedive (SI dodatak, slika S22). Međutim, kada smo usporedili ukupne razine p65 proteina Western blotom, pronašli smo značajno povećane razine p65 u Gaplinc-KO stanicama u usporedbi s WT (Slika 4G). Ovo sugerira da Gaplinc regulira ukupne razine p65 na translacijskoj razini. Osim toga, procijenili smo razine p65 u citoplazmatskim i jezgrinim odjeljcima i otkrili da je nuklearni p65 obilniji u stanicama s nedostatkom Gaplinca u usporedbi s WT (Slika 4H). U kombinaciji, ovi podaci sugeriraju mehaničku ulogu GAPLINC-a u pokretanju aktivacije kritičnih IRG-ova.

Rasprava

Ovdje smo identificirali GAPLINC kao konzerviranu citosolno izraženu IncRNA kod ljudi i miševa koja funkcionira tako da kontrolira ekspresiju upalnog gena putem regulacije NF-xB. U usporedbi s prijavljenim citosolnim IncRNA koje utječu na učinkovitost translacije moduliranjem ekspresije proteina ili sklapanja ribosoma (21-23), nalazimo da Gapline citosolno doprinosi translacijskoj sposobnosti p65; međutim, mehanizam interakcije, bilo izravne ili neizravne, tek treba utvrditi. Naša otkrića daju uvid u to kako funkcionalno očuvana IncRNA regulira imunološki odgovor i pružaju mogućnosti istraživanja za razvoj terapeutika za endotoksični šok.