13-tjedno istraživanje subkronične toksičnosti 2-(l-mentoksi)etanola u F344 štakora

Uvod

2-(1-mentoksi)etanol (CAS br. 38618-23-4) je bistra i bezbojna tekućina karakterističnog mirisa i naširoko se koristi kao sredstvo za poboljšanje okusa. Zajednički FAO/WHO stručni odbor za prehrambene aditive (JECFA) procijenio je 2-(l-metoksi)etanol kao aroma, kategoriziran kao tvari strukturno srodne mentolu1. Na temelju strukturne klase aroma, 2-(l-metoksi)etanol je dodijeljen klasi I. U Sjedinjenim Državama i Europi razine unosa 2-(l-metoksi)etanola kod ljudi procijenjeno je na 12 ug/osobi/dan i 0.01 ug/osoba/dan, oba ispod praga klase I od 1800 ug/osoba/dan. Na temelju ovih procjena, smatra se da 2-(1-mentoksi)etanol možda neće predstavljati sigurnosni problem tijekom rutinske upotrebe kao arome.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg tjelesne težine [TT])1. Unatoč upotrebi 2-(1-mentoksi)etanola kao arome, dostupni su ograničeni podaci o toksičnosti ponovljenih doza ovog spoja. Naš je laboratorij istražio toksičnost nekoliko aditiva u hrani, uključujući reprezentativne arome iz svake kategorije, na modelima glodavaca2-7. Kako bismo razjasnili toksikološki profil i uspostavili razinu bez opaženih štetnih učinaka (NOAEL), proveli smo 13-tjednu studiju subkronične toksičnosti 2-(1-mentoksi)etanola, koja je oralno primijenjen F344 štakorima gavažom.

Materijali i metode

Ispitna kemikalija

2-(1-mentoksi)etanol (Lot br. 5I0002, čistoća 99,9%) proizveden od strane Takasago Int. Corp. (Tokio, Japan) osigurao je Odjel za standarde i evaluaciju, Odjel za sigurnost hrane, Ministarstvo zdravstva, rada i socijalne skrbi, Japan, uz potporu Japanske udruge za okus i mirisne materijale (Tokio, Japan). Iako je ispitivana tvar dostavljena kao mješavina optičkih izomera (CAS br. 38618-23-4), proizvođač ju je potvrdio kao l-enantiomer (CAS br. 75443-64-0). Oralna gavaža s kukuruznim uljem (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) kao vehikulum odabrana je kao način primjene zbog netopljivosti u vodi i hlapljivosti 2-(1-mentoksi)etanola. Otopine 2-(1-mentoksi)etanola pripremane su svakodnevno, neposredno prije primjene. Nakon skladištenja 2 sata na sobnoj temperaturi, omjeri rezidua 2-(1-mentoksi) etanola u otopini od 4, 40 i 400 mg/mL potvrđeni su kao 96,8%, 99,8% i 96,5% , odnosno plinskom kromatografijom (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tokyo, Japan).

Pokusne životinje

Ukupno je 40 mužjaka i 40 ženki štakora bez specifičnih patogena (F344/DuCrlCrlj, 5 tjedana) kupljeno od Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japan) i korišteno nakon aklimatizacije tjedan dana. Tijekom studije, životinje su bile smještene u polikarbonatne kaveze s mekom podlogom, držane u prostoriji sa sustavom barijera za kontrolu ciklusa svjetlo/tama (12 h), ventilacije (brzina izmjene zraka 18 puta/h), temperature ( 24 ± 1 stupanj) i relativnoj vlažnosti (55 ± 5%). Kavezi i podloga od čipsa mijenjani su dva puta tjedno. Svaka životinja imala je slobodan pristup vodi iz slavine i bazalnoj prehrani (CRF-1; Oriental Yeast, Tokyo, Japan). Na početku eksperimenta, životinje su nasumično raspoređene u četiri skupine od po 10 muških i ženki štakora, na temelju tjelesne težine izmjerene neposredno prije početka tretmana ispitivanom kemikalijom.

Studirati dizajn

U preliminarnoj {{0}}-dnevnoj studiji koja je procjenjivala 2-(1-mentoksi)etanol primijenjen u dozama od 0, 200, 400 i 800 mg/kg TT/ dan, apsolutna i relativna težina jetre bile su značajno povećane u svim tretiranim skupinama oba spola (podaci nisu prikazani). Na temelju ovih rezultata odabrali smo doze 2-(1-mentoksi) etanola od 0, 15, 60 i 250 mg/kg TT/dan za davanje i mužjacima i ženkama štakora u sadašnjosti {{ 13}}tjedna studija toksičnosti.

Opće stanje i smrtnost procjenjivani su svakodnevno. Tjelesne težine, kao i količine opskrbljene i rezidualne hrane, mjerene su jednom tjedno tijekom eksperimentalnog razdoblja. Svi štakori su izgladnjeli preko noći nakon završetka tretmana, a uzorci krvi za hematologiju i biokemiju seruma prikupljeni su iz trbušne aorte pod dubokom inhalacijskom anestezijom pomoću izoflurana. Dizajn studije bio je u skladu sa Smjernicama za označavanje prehrambenih aditiva i reviziju standarda za upotrebu prehrambenih aditiva Japana (1996.) i odobren od strane Odbora za brigu i korištenje životinja Nacionalnog instituta za zdravstvene znanosti, Japan.

Hematologija i biokemija seruma

Sljedeći hematološki parametri analizirani su pomoću ProCyte Dx automatskih hematoloških analizatora (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, SAD): broj bijelih krvnih stanica (WBC), broj crvenih krvnih stanica (RBC), koncentracija hemoglobina (HGB), hematokrit (HCT), srednji korpuskularni volumen (MCV), srednji korpuskularni hemoglobin (MCH), srednja koncentracija korpuskularnog hemoglobina (MCHC), broj trombocita (PLT) i diferencijalne leukocitne stanice, uključujući neutrofile (Neut), limfocite (Limfa), monocite (Mono), eozinofile (Eosino), i bazofili (Baso). Biokemijska analiza seruma obavljena je Oriental Yeastom za sljedeće parametre: ukupni protein (TP), albumin (Alb), omjer albumin/globulin (A/G), ukupni bilirubin (Bil), glukoza, ukupni kolesterol (T-Chol), trigliceridi (TG), urea dušik (BUN), kreatinin (Cre), kalcij (Ca), anorganski fosfor (IP), natrij (Na), kalij (K), klor (Cl), aspartat aminotransferaza (AST), alanin aminotransferaza (ALT), alkalna fosfataza (ALP) i -glutamil transpeptidaza (-GTP).

Težina organa i histopatološka procjena

Potpuna obdukcija je obavljena za sve životinje, a izvagani su mozak, timus, pluća, srce, slezena, jetra, nadbubrežne žlijezde, bubrezi, testisi i jajnici. Ti organi, kao i tkiva iz leđne moždine, trigeminalnog živca, hipofize, nosne šupljine, žlijezda slinovnica, jezika, jednjaka, dušnika, aorte, štitne žlijezde, paratireoidne žlijezde, gušterače, želuca, tankog i debelog crijeva, submandibularnog i mezenteričnog limfni čvorovi, vagina, maternica, mokraćni mjehur, prostata, sjemene mjehuriće, epididimis, femur i prsna kost s koštanom srži, kralješci, skeletni mišići, išijatični živac, koža i mliječna žlijezda, fiksirani su u 10% neutralno puferiranom formalinu; zatim su pripremljeni rezovi uklopljeni u parafin i obojeni hematoksilinom i eozinom za histopatološki pregled. Testisi i oči s Harderianovim žlijezdama fiksirani su u Bouinovom fiksativu, odnosno u Davidsonovoj otopini. Koštana tkiva, uključujući nosnu šupljinu, kralješke, prsnu kost i bedrenu kost, dekalcificirana su upotrebom mješavine 10% mravlje kiseline i 10% puferiranog formalina do 2 tjedna. Histopatološka procjena provedena je za sva tkiva dobivena od životinja u kontrolnoj skupini i skupini kojoj je primijenjena najveća doza osim ako nisu primijećene lezije povezane s liječenjem.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE IMUNITETA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Imunohistokemija za 2u-globulin

Kod mužjaka štakora, nakupljanje 2u-globulina u bubrezima ispitano je imunohistokemijskom analizom rezova uklopljenih u parafin. Za pronalaženje antigena, rezovi dobiveni od 5 štakora u svakoj skupini inkubirani su s proteinazom K (DAKO, Glostrup, Danska) 1 minutu na sobnoj temperaturi. Sve su sekcije uronjene u 3% otopinu H2O2/metanola 10 minuta na sobnoj temperaturi radi inaktivacije aktivnosti endogene peroksidaze. Nakon blokiranja nespecifičnih reakcija s 10% normalnog zečjeg seruma, rezovi su inkubirani s primarnim antitijelom za 2uglobulin (razrijeđeno 1:400; anti-štakorsko 2u-globulinsko antitijelo; R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD) preko noći na 4 stupnja 8. Vizualizacija vezanja protutijela provedena je pomoću VectaStain Elite ABC Kita (Vector Laboratories, Burlingame, CA, SAD) i 3,3'-diaminobenzidina. Svi rezovi su obojeni hematoksilinom.

Statistička analiza

Varijacije u vrijednostima podataka za tjelesnu težinu tijekom eksperimentalnog razdoblja, kao i za hematologiju, biokemiju seruma i težinu organa, procijenjene su na homogenost pomoću Bartlettova testa. Jednosmjerna analiza varijance, odnosno Kruskal-Wallisov test, korišteni su za homogene i heterogene podatke. U određivanju statistički značajnih razlika korišten je Dunnettov test višestruke usporedbe za usporedbu kontrolne i terapijske skupine. Usporedbe histopatoloških pojava i stupnjeva analizirane su korištenjem Fisherova egzaktnog testa vjerojatnosti i Mann-Whitneyjevog U testa. P vrijednosti od<0.05 were considered statistically significant.

Rezultati

Parametri tijekom života, hematologija i biokemija seruma

Tijekom eksperimentalnog razdoblja nisu primijećeni značajni klinički znakovi i sve su životinje preživjele do planirane obdukcije. Nadalje, nisu primijećene značajne razlike u tjelesnoj težini i dnevnom unosu hrane u mužjaka i ženki štakora (Slika 1A i B).

Podaci o hematologiji i biokemiji seruma prikazani su u tablicama 1 i 2. Hematološke analize otkrile su značajno smanjen HGB, HCT, MCV i MCH i povećani PLT u mužjaka štakora kojima je davano 250 mg/kg TT/dan 2-(1-mentoksi)etanola (tablica 1). U biokemiji seruma, značajna povećanja TP, T-Chol i Ca te smanjenja Bil i ALP primijećena su kod muškaraca u skupini od 250 mg/kg (Tablica 2). Značajan porast Cre i pad A/G zabilježeni su kod mužjaka u skupinama od 60 i 250 mg/kg. U ženki je zabilježeno značajno povećanje Ca i smanjenje ALP-a u skupinama koje su primale 60 i 250 mg/kg, dok su povišeni T-Chol i smanjeni A/G, Bil, TG, AST i ALT otkriveni u skupinama koje su primale 250 mg. /kg skupine. Iako je značajno povećanje TG i smanjenje Cl primijećeno kod mužjaka koji su primili 60 mg/kg, nedostatak bilo kakvog odnosa doze sugerira da te razlike nisu povezane s izloženošću ispitivanoj tvari.

Utezi za orgulje

Podaci o težini organa sažeti su u tablici 3. Apsolutna i relativna težina jetre bile su značajno povećane u oba spola u skupini koja je primala 250 mg/kg (tablica 3). Značajno povećanje relativne težine jetre primijećeno je kod mužjaka u skupini od 60 mg/kg. U muškaraca, apsolutna i relativna težina bubrega bile su značajno povećane u skupinama od 60 i 250 mg/kg. U skupini muškaraca s dozom od 250 mg/kg, primijećena su značajna povećanja apsolutne i relativne težine nadbubrežnih žlijezda i relativne težine slezene i testisa.

Histopatologija i imunohistokemija

Podaci za histopatološke i imunohistokemijske nalaze sažeti su u tablicama 4 i 5. Histopatološki nalazi otkrili su da je učestalost nakupljanja eozinofilnih granula (Sl. 2A–D), bazofilnih tubula i hijalinskog odljeva, kao i žarišne intersticijske upale u bubregu, značajno povećana u liječenim skupinama isključivo muškaraca u usporedbi s kontrolom. skupini (Tablica 4). Na temelju imunohistokemijskih analiza, mužjaci štakora tretirani ispitivanom supstancom pokazali su povećanje imunoreaktivnosti 2u-globulina u epitelnim stanicama proksimalnih tubula, pokazujući jasnu ovisnost o dozi (Slika 2E-H) (Tablica 5).

Prilikom obdukcije, jedan mužjak štakora u skupini od 250 mg/kg pokazao je ozbiljno povećanje desnog bubrega zbog histološki karakterističnog nefroblastoma. Iako je nefroblastom neuobičajen kod većine sojeva štakora9, ovaj se slučaj smatrao slučajnim, jer nijedna druga životinja nije imala slične lezije. Osim toga, u oralnim studijama karcinogenosti, učestalost spontanog nefroblastoma u muških F344/DuCrlCrlj štakora navodno se kretala između 0–2,0%10. Iako je nekoliko lezija sporadično otkriveno u drugim organima, nisu bile očite značajne promjene ovisne o liječenju u učestalosti ovih lezija.

Rasprava

Do danas je JECFA ocijenila 24 arome, uključujući 2-(1-mentoksi) etanol, kao tvari strukturno srodne mentolu, a sve su navedene kao "bez opasnosti za sigurnost" na trenutnim procijenjenim razinama unosa1, 11. 2-(1-Mentoksi)etanol klasificira se u podskupinu alicikličkih alkohola ili etera i smatra se da je primarno konjugiran s glukuronskom kiselinom, nakon čega slijedi izlučivanje mokraćom1. Iako su oralne vrijednosti LD50 ovih tvari kod glodavaca relativno visoke, podaci iz studija toksičnosti ponovljenih doza ostaju ograničeni. 13-tjedna studija toksičnosti ponovljenih doza otkrila je da mentil pirolidon karboksilat (CAS br. 68127-22-0), spoj koji je strukturno sličan mentolu, može biti povezan s povećanom relativnom težinom jetre i bubrega kod muškaraca i žena Wistar štakori. Akumulacija 2u-globulina u proksimalnim tubulima mužjaka štakora također je opažena pri dozi od 1111 mg/kg TT/dan, a NOAEL je određen kao 109 mg/kg TT/dan1.

U ovom 13-tjednom ispitivanju subkronične toksičnosti 2-(1-mentoksi)etanola nisu primijećene toksikološke promjene u općem stanju, tjelesnoj težini i unosu hrane. Nakon hematološke procjene, primijetili smo smanjenje HGB (96,6% u odnosu na kontrolne srednje vrijednosti), HCT (96,3%), MCV (98,4%) i MCH (98,2%) te povećanje PLT (111%) u muškaraca 250 mg/kg, što se smatra toksikološkim utjecajem tretmana 2-(1-mentoksi)etanolom. I apsolutna (115% u oba spola) i relativna (119% u muškaraca i 111% u žena) težina jetre bila je značajno povećana u oba spola u skupinama koje su primale 250 mg/kg. Iako nije bilo histopatoloških promjena u jetri, povećane razine serumskog T-Chol (110% u muškaraca i 121% u žena) i TP (105% u muškaraca) i smanjenje TG (60,1% u žena) u 250 mg/kg skupine ukazuju na toksične promjene povezane s metabolizmom lipida i sintezom proteina u jetri. Također su otkriveni smanjeni HGB i MCH i povišeni PLT, T-Chol i TP kod muškaraca te smanjeni TG i povećana apsolutna i relativna težina jetre u oba spola, sa statističkom značajnošću u preliminarnoj studiji od 28- dana (podaci nisu prikazani ), potvrđujući da ti promijenjeni hematološki i biokemijski parametri seruma, kao i težine jetre, nisu bili slučajni, već učinci povezani s ispitivanom tvari. Nasuprot tome, značajno povećanje relativne težine jetre otkriveno u muškoj skupini od 60 mg/kg u ovoj studiji nije bilo popraćeno povećanjem apsolutne težine ili promjenama povezanih biokemijskih parametara, što sugerira da je to povećanje adaptivna promjena.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Smatra se da su značajno povećane apsolutne (120%) i relativne (118%) težine nadbubrežnih žlijezda u skupini muškaraca s dozom od 250 mg/kg povezane s ispitivanom kemikalijom. Nadalje, povećana apsolutna i relativna težina nadbubrežnih žlijezda u oba spola pokazala je jasnu ovisnost o dozi u 28--dnevnoj preliminarnoj studiji (podaci nisu prikazani), što ukazuje na povezanost s tretmanom ispitivanom kemikalijom. Iako bi hipertrofija nadbubrežne žlijezde mogla biti posljedica stresa, nije bilo nalaza koji bi upućivali na stres, kao što je smanjeni dobitak tjelesne težine ili atrofija timusa i drugih limfoidnih organa, kako u sadašnjim tako iu preliminarnim studijama. Budući da možda nema histopatoloških promjena u nadbubrežnoj žlijezdi čak i uz oslabljenu proizvodnju glukokortikoida u slučajevima inhibicije enzima povezanih sa steroidogenezom12, ne može se isključiti mogućnost da je povećana težina nadbubrežne žlijezde toksični nalaz. Nasuprot tome, povećana relativna težina slezene i testisa u skupini muškaraca s 250 mg/kg, koja nije primijećena u preliminarnoj studiji, smatrana je toksikološki beznačajnom zbog odsutnosti histopatoloških lezija ili značajno povećane apsolutne težine. Slično, biokemija seruma otkrila je smanjenje A/G i povećanje Ca u oba spola, za što se smatralo da nema toksikološki značaj, s obzirom na to da nisu otkrivene abnormalnosti u povezanim parametrima. Nadalje, smanjene razine Bil i ALP u oba spola i smanjeni AST i ALT u žena bili su u suprotnosti s očekivanim toksičnim učincima i smatrani su beznačajnim.

Kronična nefropatija karakterizirana bazofilnim tubulima, hijalinskim odljevom i žarišnom intersticijskom upalom primijećena je sa statističkom značajnošću u muškaraca svih liječenih skupina. Uz to, povećani Cre u serumu te apsolutna i relativna težina bubrega otkriveni su u muškim skupinama od 60 i 250 mg/kg; te promjene nisu uočene u skupinama koje su liječene ženama. U tim slučajevima, stupanj nakupljanja eozinofilnih granula u proksimalnim tubularnim epitelnim stanicama bio je povećan na očigledan način ovisan o dozi. Ove su granule imunohistokemijski potvrđene kao 2u-globulin, što ukazuje na pojavu 2u-globulinske nefropatije. 2u-globulini vezani za određene kemikalije, kao što je d-limonen, nakupljaju se u lizosomima i opažaju se u proksimalnim tubulima kao eozinofilne ili hijalinske granule9. Ovo nakupljanje može oštetiti epitelne stanice, što dovodi do kronične progresivne nefropatije i posljedičnog stvaranja tumora9. Stoga, iako NOAEL za 2-(1-mentoksi)etanol povezan s 2u-globulinskom nefropatijom u bubrezima mužjaka štakora nije identificiran, ovaj tip nefropatije je navodno specifičan za mužjake štakora i stoga nije relevantan za ljude procjena rizika13. Povećani rizik od zatajenja bubrega posredovan putem mehanizama povezanih s nakupljanjem 2u-globulina vrlo je nevjerojatan, budući da ovaj protein nedostaje u ljudi14. Stoga se smatralo razumnim isključiti promjene povezane s kroničnom nefropatijom opažene u muškaraca iz određivanja NOAEL-a.

Zaključno, ova 13-tjedna studija subkronične toksičnosti pokazala je da je liječenje 2-(1-mentoksi) etanolom od 250 mg/kg TM/dan 2-(1-mentoksi) etanola uzrokovalo toksične promjene u hematologiji, biokemiji seruma i težini organa u muških i ženki F344 štakora. Na temelju opaženih rezultata, NOAEL 2-(1-mentoksi)etanolaprocijenjena je kao 60 mg/kg TM/dan za oba spola.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%