[6]-Gingerol olakšava lučenje CXCL8 i proizvodnju ROS-a u primarnim ljudskim neutrofilima ciljanjem TRPV1 kanala, 1. dio

1. Uvod

Identifikacija sastojaka hrane s imunomodulacijskim svojstvima zajedno s njihovim odgovarajućim molekularnim ciljevima privukla je povećani interes posljednjih godina. Zbog velike raznolikosti liganda, prijelazna receptorska potencijalna superobitelj ionskih kanala (TRP kanali) predstavlja vrlo zanimljivu klasu potencijalnih ciljnih struktura.

Molekularna meta je određena molekula na koju lijek djeluje u tijelu. Imunitet se odnosi na snagu sposobnosti tijela da se odupre bolesti.

Bliska veza postoji između molekularnih ciljeva i imuniteta. Učinci lijekova često utječu na imunitet organizma. Na primjer, određeni lijekovi mogu liječiti određene kronične bolesti ometanjem funkcije imunološkog sustava organizma. Osim toga, liječenje tumora često koristi ciljanu terapiju, odnosno ciljanje određenih molekularnih ciljeva za napad na stanice raka, čime se poboljšava sposobnost imuniteta da se bori protiv stanica raka.

Osim toga, snaga imuniteta također će utjecati na učinak lijekova. Osobe s oslabljenim imunološkim sustavom mogu doživjeti nuspojave ili manje učinkovite lijekove kada se koriste jer imunološki sustav ne apsorbira dobro lijekove, što rezultira manje učinkovitim liječenjem. Stoga je održavanje zdravog imunološkog sustava vrlo važno za terapiju lijekovima.

Zaključno, postoji bliska veza između molekularnih ciljeva i imuniteta, a potpuno razumijevanje tog odnosa od velike je važnosti za racionalnu upotrebu lijekova. Trebamo aktivno jačati svoj imunitet, pravilno koristiti lijekove prema savjetu liječnika, ciljanom terapijom jačati imunitet kako bismo bolje zaštitili svoje zdravlje. S ove točke gledišta, moramo poboljšati svoj imunitet. Cistanche može značajno poboljšati imunitet jer Cistanche ima i antivirusno i antikancerogeno djelovanje, što može ojačati sposobnost imunološkog sustava za borbu i poboljšati imunitet organizma.

Kliknite zdravstvene prednosti cistanche

Superobitelj TRP kanala sisavaca uključuje šest srodnih obitelji proteina, naime ankirinsku (TRPA), kanoničku (TRPC), melastatinsku (TRPM), mukolipinsku (TRPML), policistinsku (TRPP) i vaniloidnu (TRPV) obitelj, svi oni tipično dijele šest transmembranskih segmenata koji se skupljaju kao tetrameri da tvore pore propusne za katione s različitom selektivnošću kationa.[1] TRPV1 kanal je možda daleko najintenzivnije istraženi član TRP superobitelji. TRPV1 je u početku identificiran kao receptor za kapsaicin, ljutu komponentu čili papričica.[2] Kasnije se također pokazalo da ljuti sastojci iz đumbira, gingeroli, aktiviraju TRPV1.[3]

Biološka uloga TRPV1 u tipovima ne-neuronskih stanica još uvijek je pod opsežnim istraživanjem, ali dostupni rezultati impliciraju funkcije daleko iznad osjetilne i toplinske percepcije. Na primjer, 12-tjedna intervencija s dnevnom dozom od 0,15 mg agonista TRPV1 nonivamida, strukturnog analoga kapsaicina, spriječila je dijetom inducirano povećanje tjelesne masne mase i povećala serotonin u plazmi razine kod zdravih ispitanika s prekomjernom težinom.[4]

U 3T3-L1 adipocitima aktivacija TRPV1 nenivamidom smanjila je nakupljanje lipida tijekom diferencijacije i sazrijevanja potiskivanjem ekspresije PPAR𝛾.[5] U makrofazima, kapsaicin i nonivamid oslabili su LPS-om izazvano otpuštanje proupalnih citokina poput IL6, CXCL8 i TNF-alfa, na način ovisan o TRPV1-.[6] Ipak, posebne funkcije TRPV1 u leukocitima ljudske krvi ostaju nejasne. U ljudskim NK stanicama, 10 i 50 µM kapsaicina izazvalo je porast unutarstaničnih koncentracija Ca2 plus, što ukazuje na funkcionalni TRPV1 kanal.[7]

Međutim, prigušene efektorske funkcije NK stanica kao što su citotoksična degranulacija i izlučivanje citokina, izazvane prethodnim tretmanom stanica kapsaicinom tijekom 1 sata u rasponu koncentracija od 10–100 μM, bile su uvelike neovisne o TRPV1.[7] ] U T stanicama je dokumentirano da je TRPV1 uključen u procese signalizacije T staničnih receptora, proliferaciju i diferencijaciju T stanica, kao i proizvodnju citokina.[8] Prethodni rad naše grupe također je pokazao funkcionalnu ekspresiju TRPV1 u ljudskim primarnim T stanicama.[9] Nadalje, analize doze i odgovora u koncentracijama u rasponu od 0,03 do 300 μmol L-1 otkrile su da [6]-gingerol inhibira izlučivanje citokina od strane primarnih ljudskih leukocita s IC50 vrijednošću od 82,2 μmol L-1.

Međutim, kvantifikacija [6]-gingerola u uzorcima plazme zdravih ispitanika otkrila je srednju maksimalnu koncentraciju u plazmi od samo 42.0 ± 16,3 nmol L−1 nakon uzimanja 1 L čaja od đumbira. Budući da ove koncentracije [6]-gingerola nisu imale značajan utjecaj na izlučivanje citokina u prethodnim studijama, [9] nejasno je je li koncentracija od 50 nmol L-1, koja je relevantna za ishranu, postignuta u krvnoj plazmi nakon konzumiranja 1 L đumbira. čaja, dovoljan je za modulaciju staničnih imunoloških odgovora u drugim ljudskim primarnim leukocitima.

Za ljudske neutrofile znanje o funkcionalnoj ulozi TRPV1 je ograničeno. Dok su Köse i Nazıroglu˘ [10] pokazali Ca2 plus -tokove u neutrofilima kao odgovor na 10 µM kapsaicina koji treba smanjiti TRPV1 antagonistom kapsazepinom, drugi rezultati nisu pokazali da kapsaicin inducira Ca2 plus influks kada je testiran u rasponu koncentracija od 1 –100 μM, unatoč ekspresiji RNK TRPV1 koja se može detektirati.[11]

Neutrofili su najzastupljeniji leukociti u ljudskoj krvi, čineći 60-70 posto svih cirkulirajućih bijelih krvnih stanica. One su prve imunološke stanice koje se regrutiraju na mjesta infekcije; stoga se često nazivaju prvom linijom obrane.[12] Regrutiranje neutrofila pokreću, između ostalog, bakterijski ili mitohondrijski peptid N-formilmetionin-leucil-fenilalanin (fMLF) ili kemokini kao što je CXCL8 (IL-8).[13]

Obrambeni mehanizmi neutrofila uključuju fagocitozu, [14] otpuštanje antimikrobnih enzima putem degranulacije, [15] stvaranje reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) [16] i stvaranje izvanstaničnih zamki neutrofila.[17] Osim ovih izravnih obrambenih mehanizama, neutrofili dodatno pridonose kasnijim imunološkim odgovorima putem otpuštanja raznih citokina i kemokina.[18] Također, neutrofili mogu proći proces pripreme koji im omogućuje snažniji odgovor na kasniju punu aktivaciju.[16b]

Posljednjih godina sve je više dokaza da sastojci iz hrane i/ili ljekovitog bilja mogu modificirati jedan ili više spomenutih obrambenih odgovora ljudskih neutrofila. Ove modifikacije uključuju povećanu fagocitotsku aktivnost[19] i stvaranje ROS-a, [20] povećanu kemotaksiju prema fMLF-u, [21] i stvaranje izvanstaničnih zamki neutrofila.[20] Međutim, aktivni spoj(evi) nije identificiran. Sastojci iz Ferula akitschkensis (𝛽-pinen, sabinene, 𝛾-terpinen, geranil aceton i izobornil acetat) desenzibilizirali su neutrofile na fMLF- i CXCL8- inducirani Ca2 plus influks i inhibirali fMLF induciranu kemotaksiju, pri čemu geranil aceton- inducirani učinci bili su posredovani putem TRPV1.[22]

Na temelju dostupnih podataka, pretpostavili smo da ligandom inducirana aktivacija TRPV1 pomoću [6]-gingerola može utjecati na opće funkcije neutrofila, bilo izravno ili putem pojačavanja njihovih odgovora na aktivirajuće podražaje. U okviru ove hipoteze, posebno smo željeli razjasniti je li verificirana nutritivno relevantna koncentracija dovoljna za modulaciju staničnih imunoloških odgovora u ljudskim primarnim neutrofilima kao dijelu populacije leukocita. '

Nadalje, nastojali smo usporediti razine ekspresije RNA svih članova superobitelji TRP sisavaca u pet najistaknutijih tipova stanica u ljudskoj krvi kako bismo dobili kvalitativno i kvantitativno sveobuhvatan pregled ekspresije TRP kanala u ljudskim leukocitima.

2. Rezultati

2.1. Brojnost i relativne razine transkripta TRP kanala u ljudskim leukocitima

Kako bi se procijenila ekspresija RNK TRP kanala u leukocitima u krvi, pet najistaknutijih tipova stanica leukocita izolirano je iz krvi zdravih darivatelja, a ekspresija RNK TRP kanala analizirana je kvantitativnom RT-PCR (Slika 1).

Specifični transkripti TRPV-a kao i TRPM obitelji otkriveni su s visokim učestalostima od 75–100 posto u svim analiziranim tipovima stanica. Prosječna ukupna učestalost uzimajući u obzir sve vrste stanica bila je 96 posto za obitelj TRPV i 98 posto za obitelj TRPM. Transkripti specifični za TRPC bili su puno manje zastupljeni, u rasponu od 0 posto u monocitima, NK stanicama, T stanicama i B stanicama do 100 posto u NK stanicama i T stanicama s ukupnom prosječnom učestalošću od samo 53 posto (Slika 1A). TRPC5-specifični transkript otkriven je samo u neutrofilima, s učestalošću od 70 posto.

Također, transkript specifičan za TRPA1- općenito je otkrio prilično nisku zastupljenost u analiziranim tipovima stanica s učestalošću od 100 posto u neutrofilima, 25 posto u monocitima, 80 posto u NK stanicama, 100 posto u T stanicama i 60 posto u B stanicama. Isto tako, transkript specifičan za TRPML3- pokazao je nisku učestalost u neutrofilima (50 posto), monocitima (25 posto), NK stanicama (40 posto) i B stanicama (20 posto), ali učestalost od 100 posto u T stanice. Transkript specifičan za TRPV1- otkriven je u svim tipovima stanica, pokazujući učestalost od 100 posto u monocitima, NK stanicama i T stanicama, te učestalost od 90 posto u neutrofilima i 80 posto u B stanicama.

Što se tiče relativne ekspresije RNA, u usporedbi s odgovarajućim frekvencijama, TRP kanali su otkrili uzorak ekspresije više specifičan za stanični tip, što je vidljivo usporedbom odgovarajućih Δct vrijednosti u različitim analiziranim tipovima stanica (Slika 1B). Na primjer, TRPP3 je otkriven s učestalošću od 100 posto u svim tipovima stanica, ali je otkrio najvišu razinu ekspresije u monocitima.

Nasuprot tome, kanal TRPV2 otkriven je u svim ispitivanim tipovima stanica, s relativno visokom razinom ekspresije RNA kao i visokom učestalošću. Isto tako, razine transkripta TRPV1 bile su slične u svim ispitanim vrstama stanica (Slika 1B).

2.2. TRPV1 površinska ekspresija na neutrofilima

Trenutno znanje o funkciji TRPV1 u ljudskim neutrofilima još uvijek je nejasno. Kako bismo dodatno istražili uloge TRPV1 u ljudskim neutrofilima, zatim smo istražili eksprimira li se TRPV1 kanal na površini primarnih ljudskih neutrofila pomoću protočne citometrije živih stanica (Slika 2).

Izolirani neutrofili su obojeni na CD15 kao površinski marker za neutrofile (Slika 2A, B) i istovremeno su obojeni antitijelom podignutim protiv epitopa u prvoj izvanstaničnoj petlji proteina TRPV1 (Slika 2B) ili odgovarajućom izotipskom kontrolom, potonji služi kao surogat za mjerenje nespecifičnog vezanja (Slika 2A). Unutar CD15 plus populacije, analiziran je intenzitet fluorescencije za FITC. Bojanje neutrofila protutijelom TRPV1 dovelo je do vidljivog signala fluorescencije u usporedbi s kontrolom izotipa, čime je potvrđena površinska ekspresija TRPV1 u primarnim ljudskim neutrofilima (Slika 2C). Analizom neutrofila četiri pojedinačna donora otkrivena je usporediva površinska ekspresija TRPV1 (Slika 2D).

2.3. [6]-Gingerolom inducirano povećanje intracelularnog Ca2 plus

Budući da će ligandom inducirana aktivacija TRPV1 rezultirati priljevom Ca2 plus, [23] intracelularne Ca2 plus koncentracije neutrofila određene su pomoću boje Fura-2 osjetljive na Ca2 plus. Na temelju naših prethodnih otkrića [9] odabrana je koncentracija od 50 nM dobro poznatog liganda TRPV1 [6]-gingerola i vrijeme inkubacije od 2 sata. Analize su pokazale da je inkubacija neutrofila s 50 nM [6]-gingerola rezultirala povećanjem unutarstaničnih koncentracija Ca2 plus koje su u prosjeku iznosile 18,4 posto ± 1,0 posto maksimalne vrijednosti, utvrđene primjenom 1 μM ionofora ionomicina. Povećanje izazvano DMSO bilo je 4,7 posto ± 1,2 posto (Slika 3).

2.4. Utjecaj [6]-Gingerola na ekspresiju TRPV1

Zatim smo ciljali na analizu utjecaja stimulacije TRPV1 pomoću [6]-gingerola na ekspresiju TRPV1 na razini transkripta putem q-RTPCR kao i na razini površinskih proteina putem bojenja živih stanica. U tu svrhu, ljudski neutrofili su inkubirani s 50 nM [6]-gingerola tijekom 2 h, a odgovarajuće razine ekspresije su kvantificirane.

Ova dvosatna inkubacija nije utjecala niti na transkript TRPV1 niti na razine proteina (Slika 4), a također nije promijenila, osim za IL6, IL17A, IL24, C5 i GDF5, ekspresiju RNK uobičajenih istraživanih gena za citokine i kemokine (Slika S1, Tablica S2, popratne informacije).

2.5. Utjecaj [6]-Gingerola na ekspresiju površinskih markera neutrofila

U ovom skupu eksperimenata pitali smo ima li [6]-gingerol utjecaj na ekspresiju uobičajenih površinskih markera za neutrofile. Otkrili smo da je ekspresija markera CD11b i CD66b povećana nakon 2 sata inkubacije s [6]-gingerolom u usporedbi s kontrolom otapala, dok je CD62L ostao nepromijenjen (Slika 5). Nadalje, površinska ekspresija fMLF receptora FPR1 bila je značajno povišena nakon tretmana stanica s 50 nM [6]-gingerola u usporedbi s kontrolom otapala.

For more information:1950477648nn@gmail.com